抗菌肽CRAMP的安全性、稳定性及其在清除铜绿假单胞菌生物被膜中的作用

摘要：

旨在考察鼠源抗菌肽CRAMP的安全性、稳定性及其在清除铜绿假单胞菌生物被膜中的作用.采用兔血红细胞悬液的溶血性和小鼠腹腔巨噬细胞(RAW264.7)的细胞毒性考察CRAMP的安全性;采用不同温度、蛋白酶、金属离子和酸碱梯度对CRAMP抗菌活性的影响,考察其稳定性;通过在6孔细胞培养板中构建铜绿假单胞菌(PAO1株)成熟生物被膜,以人源抗菌肽LL-37和3种抗菌药为对照,采用结晶紫染色法检测生物被膜量,平板菌落计数法对生物被膜活菌数进行计数,苯酚-硫酸法结合Folin-酚试剂法检测生物被膜胞外基质含量,激光扫描共聚焦显微镜(CLSM)观察CRAMP干预PAO1生物被膜形态学的变化.结果显示,CRAMP在所测试浓度下对兔血红细胞溶血率均＜2％;在62.5～125 mg·L-1时对RAW264.7没有细胞毒性.温度(25～100℃)、两种盐离子(Na+、K+)以及pH为5～10时对CRAMP的抗菌活性没有影响;胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶均不同程度影响了 CRAMP的抗菌活性.6孔细胞培养板中,4倍MIC的CRAMP极显著降低了 PAO1生物被膜量(减少率为76.74％,P＜0.01),极显著减少了生物被膜中的活菌数量(减少了 1.2个CFU·mL-1,P＜0.01),效果优于LL-37和3种抗菌药.CRAMP组的胞外基质显著低于空白对照组和LL-37组(P＜0.05).CLSM结果显示:与对照组相比较,4MIC浓度下,CRAMP组的细菌总荧光强度(PI+SYTO)显著低于空白对照组和LL-37组(P＜0.05);与空白对照组相比,CRAMP组和LL-37组的死菌荧光强度/活菌荧光强度比值(PI/SYTO)均极显著增大(P＜0.01).综上表明,CRAMP具有低溶血性、低细胞毒性,除蛋白酶作用不稳定外,具有较好的稳定性,对PAO1成熟生物被膜具有明显的清除作用,且效果优于LL-37,具有良好的药物开发前景.

关键词：生物被膜、鼠源抗菌肽CRAMP、细胞毒性、稳定性、激光扫描共聚焦显微镜

所属期刊栏目：53

分类号：S852.4;S853.7(动物医学（兽医学）)

资助基金：重庆市研究生科研创新项目;中央高校基本科研业务费专项资金资助项目;重庆市基础研究与前沿探索项目;重庆市教育教学改革项目

在线出版日期：2022-06-15（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共11页

页码：1576-1586