鸡Toll样受体15单克隆抗体的制备及其初步应用

摘要：

旨在制备鸡Toll样受体15 (ChTLR15)的特异性单克隆抗体(mAb),并初步应用.利用PCR技术扩增ChTLR15第162-386位氨基酸,克隆于载体pET-30a中进行诱导表达,获得高纯度的重组ChTLR15 (162-386 aa)蛋白.然后采用皮下多点注射方式将ChTLR15免疫6周龄的雌性BALB/c小鼠,常规获得针对ChTLR15蛋白的单克隆抗体.运用原核表达系统对ChTLR15基因进行截短表达,对单克隆抗体针对的ChTLR15抗原表位进行鉴定.利用6C7株单克隆抗体以激光共聚焦显微技术对鸡HD11细胞进行定位,同时,利用免疫组化技术确定ChTLR15在鸡部分组织中的分布情况.结果 表明:成功构建重组质粒pET-30a-ChTLR15(162-386 aa),经IPTG诱导表达后,获得以包涵体形式存在的约26 ku的重组蛋白ChTLR15(162-386 aa).方阵试验表明,最适血清稀释度为1∶6400,最适抗原包被浓度为0.35 μg·mL-1.采用有限稀释法进行4轮筛选,最终获得4株针对ChTLR15蛋白的单克隆抗体,将其以2G4、6C7、6D10、7C4进行命名.2G4与6C7的亚类为IgG2a,6D10与7C4的亚类为IgG1.Western blot结果显示,4株单抗均能与ChTLR15发生特异性反应,而不与其他受检蛋白反应.运用原核表达系统对ChTLR15 (162-386 aa)进行截短表达,对ChTLR15单克隆抗体的抗原表位进行鉴定.结果 显示,单抗2G4与7C4识别的抗原表位为230 QLGTVLEF237,6C7与6D10识别的抗原表位为245 EMDLLS250.细胞定位结果显示,ChTLR15蛋白位于细胞表面.免疫组化结果显示,健康对照鸡肝、脾、肺、肾均有微弱阳性染色,禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli,APEC)感染鸡肝、脾、肺、肾阳性染色有所增强.本研究通过淋巴细胞杂交瘤技术成功获得4株抗ChTLR15蛋白的单克隆抗体,通过截短免疫原蛋白法对其识别的线性表位进行鉴定,可用于进一步研究ChTLR15的结构与功能,为后续信号通路、免疫机理、疫苗研发等相关领域的研究提供了有力工具.

关键词：ChTLR15;单克隆抗体;抗原表位;免疫组化;细胞定位

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分类号：S852.4(动物医学（兽医学）)

资助基金：国家自然科学基金;国家自然科学基金;国家自然科学基金;国家重点研发计划;国家重点研发计划;扬州大学大学生创新创业训练计划;江苏高校优势学科建设工程资助项目

在线出版日期：2022-03-16（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共12页

页码：576-587