Beclin-1基因shRNA慢病毒载体的构建及其对B16F10细胞自噬及活力的影响

摘要：

利用RNA干扰技术构建稳定沉默Beclin-1基因的B16F10小鼠黑色素瘤细胞系,分析稳转细胞系的自噬水平和活力,为探讨Beclin-1基因、自噬与肿瘤三者关系奠定基础.构建小鼠Beclin-1基因干扰载体,转染至293T细胞,获得慢病毒颗粒,将病毒颗粒感染B16F10细胞,通过加压筛选、有限稀释、细胞驯化得到稳定转染m-Beclin-1-shRNA1的B16F10细胞系.采用RT-PCR和免疫荧光技术检测对Beclin-1的干扰效果,Western blot和透射电镜分析稳转细胞系中自噬标志物LC3蛋白表达及自噬小体形成情况,CCK-8法检测稳转细胞系的活力.结果 表明,成功构建了靶向抑制Beclin-1基因表达的shRNA,纯化的慢病毒滴度为1×108 TU·mL-1,建立的细胞系中Beclin-1 mRNA和蛋白表达都受到不同程度的抑制,mRNA的沉默效率约为75％ (P＜0.01),发现干预Beclin-1表达能够抑制LC3-Ⅱ蛋白的表达及自噬小体的形成数量,降低B16F10细胞活力.以上结果表明,干扰Beclin-1表达能够有效降低B16F10细胞自噬活性,促进B16F10细胞死亡,这为探讨Beclin-1基因功能及自噬在抗肿瘤中的作用奠定重要基础.

关键词：RNA干扰;B16F10细胞;Beclin-1基因;慢病毒载体;细胞自噬

所属期刊栏目：52

分类号：S852.2(动物医学（兽医学）)

资助基金：国家自然基金项目;河南科技大学省部级科技创新平台培育项目

在线出版日期：2021-11-08（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共8页

页码：2609-2616