二代靶向测序在CRISPR/Cas9靶区筛选中的应用性研究

摘要：

旨在利用二代靶向测序技术比较不同靶区对CRISPR/Cas9基因编辑结局的影响,为该技术应用过程中的靶区筛选提供技术参考.本研究进行如下试验:1)以小鼠Pyk2基因为研究对象,针对其第一外显子区设计3个靶区,通过打靶质粒构建、细胞转染及转染细胞DNA二代靶向测序等手段发现,不同靶区总体的基因编辑(Indels)效率相差较大(site1:32.0％;site2:7.9％;site3:69.5％),编辑修复的偏好性也存在较大区别;而对于同一靶区,总编辑效率在2组试验重复中较为稳定(site1:31.8％ vs 32.3％;site2:7.4％vs 8.4％;site3:71.3％vs 67.8％),编辑的偏好性也相对一致;2)针对上述筛出的最佳靶区site1,通过sgRNA与Cas9体外转录、小鼠胚胎显微注射和移植及子代的基因型鉴定等手段,结果发现,上述靶区的基因编辑偏好性在基因编辑动物生产中也得到证实;3)利用上述得到的site1靶区插入一个碱基的突变小鼠,在原靶区位置设计与site1仅相差一个碱基的sgRNA.通过突变小鼠基因组PCR和Cas9酶体外切割试验发现,靶区切割位点单碱基的插入就对该靶区编辑的效率产生显著影响(49.2％vs 0％).综上所述,靶区选择对CRISPR/Cas9基因编辑的结局影响显著,通过二代靶向测序可以有效筛选CRISPR-Cas9基因编辑靶区,并在模式动物生产过程中也获得较好的结果.此外,针对靶区切割位点的单个碱基插入对基因编辑效率影响显著.

关键词：靶向测序、CRISPR/Cas9、基因编辑、Pyk2

所属期刊栏目：50

分类号：S813(普通畜牧学)

资助基金：国家重点研发项目2018YFC1003004

在线出版日期：2019-09-16（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共9页

页码：1587-1595