PK-15细胞敲除TANK结合激酶1基因促进猪伪狂犬病病毒复制的研究

摘要：

TANK结合激酶1(TBK1)是病毒感染时IRF3、IRF7磷酸化及Ⅰ型干扰素表达的关键酶,在抗病毒天然免疫应答和获得性免疫应答中发挥重要作用.为研究TBK1基因敲除对猪伪狂犬病病毒(PRV)复制的影响,首先利用CRISPR/Cas9技术构建猪TBK1基因稳定敲除PK-15细胞系,并利用CCK-8检测敲除TBK1对PK-15细胞活力的影响.然后利用流式细胞术检测PRV-GFP荧光强度,用RT-qPCR检测PRV-gB、PRV-gE、PRV-TK、IL-1β、IFN-β和ISG15的转录水平,用Western blot检测PRV-gB和PRV-gE蛋白表达水平,以及通过滴度测定检测子代病毒的感染力,综合评价TBK1基因稳定敲除PK-15细胞对PRV病毒复制的影响.结果 显示:T7E1检测结果显示TBK1基因外显子2区的3个sgRNA靶位点均切出了目的条带,选取编辑效率最高的TBK 1-sgRNA1细胞系进行单克隆化培养,获取6株稳定敲除TBK1基因的单克隆细胞,随机选取4号细胞株进行CCK-8检测,结果显示敲除TBK1对PK-15细胞活力无影响.流式检测结果显示PRV-GFP感染阳性细胞占总PK-15细胞的56.89％,PRV-GFP感染阳性细胞占总PK-15-TBK1-/-细胞的77.95％,表明PK-15-TBK1-/-细胞可以促进PRV-GFP复制.RT-qPCR及WB检测显示该细胞系可以促进PRV mRNA转录和蛋白表达.滴度测定结果显示,PRV-QXX在PK-15细胞复制后TCID50为106.8 TCID50·0.1 mL-1,而在PK-15-TBK1-/-细胞中复制后TCID50为108.5 TCID50·0.1 mL-1.另外,RT-qPCR结果显示该细胞系可以抑制PRV感染引起的IL-1β、IFN-β和ISG15转录上调.以上结果表明TBK1基因敲除PK-15细胞系促进PRV复制,可能与IL-1β、IFN-β和ISG15转录水平抑制有关.

关键词：CRISPR/Cas9、TANK结合激酶1、基因敲除、猪伪狂犬病病毒

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分类号：S852.659.1(动物医学（兽医学）)

资助基金：转基因生物新品种培育重大专项2016ZX08006001-006;国家自然科学基金31502031;霍英东教育基金会高等院校青年教师基金151033;优势特色学科建设经费203/18xk0102

在线出版日期：2019-07-17（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共10页

页码：1239-1248