牛支原体EF-Tu基因的克隆表达、亚细胞定位及间接ELISA方法建立

摘要：

旨在获得牛支原体延伸因子EF-Tu蛋白,分析其在牛支原体菌体内的分布情况,建立EF-Tu间接ELISA法,为进一步研究牛支原体EF-Tu的生物学功能提供理论依据,也为建立牛支原体有效的血清学诊断方法和亚单位疫苗的研制奠定基础.参照Uniprot数据库中M.bovis PG45株EF-Tu基因序列,应用Overlap PCR扩增获得EF-Tu基因并将其克隆至pMD19-T载体,测序正确后,构建pET32a-EF-Tu原核表达载体,转化大肠杆菌BL21表达菌,IPTG诱导表达,纯化后的表达产物免疫新西兰兔(New Zealand rabbit)制备多克隆抗体,利用间接ELISA测定高免血清抗体效价,用Western blot和间接ELISA法初步定位EF-Tu在菌体内的分布,通过优化反应条件,建立间接ELISA检测法.结果表明:重组蛋白EF-Tu约为66 ku,主要以可溶性形式表达;采用间接ELISA测定的多克隆抗体效价为1:6 400;Western blot和ELISA表明该蛋白在牛支原体细胞质和细胞膜中均有表达,且含量相当.利用EF-Tu建立的ELISA法具有很好的特异性和敏感性.通过原核表达系统成功得到牛支原体延伸因子的重组蛋白,该蛋白分布于菌体细胞质和膜表面,且含量基本相当.本研究所建立的EF-Tu ELISA法适合大规模的血清学诊断检测.

关键词：牛支原体、原核表达、多克隆抗体、亚细胞定位、ELISA

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分类号：S852.62(动物医学（兽医学）)

资助基金：2017年内蒙古农业大学动植物新品种选育培育专项YZGC2017027;国家科技支撑计划资助项目2012BAD13B00

在线出版日期：2019-03-11（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共9页

页码：134-142