鸭肠炎病毒疫苗株EvaGreen实时荧光定量PCR方法的建立

摘要：

鸭肠炎病毒(duck enteritis virus,DEV)疫苗株自1960年以来一直被用于防控DEV感染,该疫苗安全稳定、生产技术成熟、可快速诱导机体体液免疫和细胞免疫.DEV的基因组庞大,复制非必需区多,可容纳多个外源基因的插入,被广泛用来作为基因工程载体来开发疫苗.当前,尚未见仅针对DEV疫苗株的实时荧光定量PCR检测方法相关研究报道.本研究通过分析DEV疫苗株和强毒株UL2基因特点,明确DEV疫苗株在UL2基因上存在528 bp连续核苷酸缺失,设计针对该差异的实时荧光定量PCR引物,建立了EvaGreen实时荧光定量PCR检测DEV疫苗株的方法.结果表明,建立的检测DEV疫苗株实时荧光定量检测方法,当UL2基因含量为5.25×101～5.25×106拷贝·μL-1时有良好的线性扩增,其标准曲线方程Y轴截距为34.95,斜率为-3.218,扩增相关系数为0.999,扩增效率为100％;敏感性强,最低检测限为52.5拷贝·μL-1;特异性好,对DEV疫苗株扩增产物的熔解曲线分析,仅出现1个单特异峰值[Tm=(90.62±0.28)℃],无引物二聚体,对其他鸭源传染病病原(如鸭肠炎病毒强毒、番鸭细小病毒、鸭圆环病毒、番鸭源鹅细小病毒、新型基因重组型鸭细小病毒、鸭腺病毒A型、鸭源鹅多瘤病毒、鸭源大肠杆菌、鸭疫里默菌和鸭源禽多杀性巴氏杆菌)检测均为阴性;重复性好,组内变异系数和组间变异系数分别为0.55％～～1.72％和0.92％～2.49％.本研究建立了DEV疫苗株实时荧光定量检测方法,为评价DEV活载体基因工程疫苗免疫防控机制提供参考.

关键词：鸭肠炎病毒、疫苗株、UL2基因、EvaGreen、实时荧光定量PCR方法

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分类号：S852.659.1(动物医学（兽医学）)

资助基金：国家自然科学基金31602068;国家水禽产业体系CARS-42;福建省农业科学院青年科技创新团队STIT2017-3-10;福建省农业科学院青年科技英才项目YC2015-12;福建省属公益类科研院所基本科研项目2018R1023-5,2017R1023-7

在线出版日期：2018-08-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共9页

页码：1558-1566