猪LTβR基因克隆、结构功能预测、组织表达谱分析及真核表达载体构建

摘要：

为了进一步探究猪LTβR基因的生物学功能,本研究以猪淋巴组织cDNA为模板扩增LTβR基因CDS区,进一步利用生物信息学对猪LTβR蛋白结构与功能以及参与的GO和Pathway通路进行分析,利用Real-time PCR检测LTβR基因在大白猪不同组织中的表达水平,同时将LTβR基因扩增产物克隆至真核表达载体pEGFP-C1中,并分别转染猪HEK293和IPEC-J2小肠上皮细胞系,通过显微镜观察其表达情况.结果表明,克隆获得猪LTβR基因CDS区全长为1 209 bp,编码402个氨基酸,发现LTβR为脂溶亲水性的不稳定蛋白,存在1个跨膜结构(205～227 aa),不存在信号肽,亚细胞定位表明LTβR为非分泌型蛋白.LTβR蛋白具有2个糖基化位点,18个潜在的磷酸化位点,其中包括PKC、CKI、CDC2、GSK3、CDK5、INSR等10种保守的特异性蛋白质激酶的结合位点.该蛋白保守区域为2个TNFR superfamily,分别位于32～125和128～192位氨基酸,并发现C422T＞A141V突变位于该区域内.KEGG和GO分析发现,LTβR基因共参与12项GO功能分类,同时还参与NF-kappa B信号通路、IgA合成的肠道免疫网络等5项调控通路.定量检测发现,L TβR基因在大白猪肺中的表达水平极显著高于其他组织(P＜0.01),在肾和脾等免疫器官,十二指肠和空肠等肠道组织中也均有较高的表达水平.细胞水平转染试验及显微镜观察发现其在猪HEK293和IPEC-J2两种细胞中均表达.本研究为猪LTβR基因及其介导的信号通路的功能分析提供了材料和依据,今后有必要在细胞水平上进一步验证分析猪L TβR基因及其介导的信号通路在猪抵抗细菌感染过程中发挥的重要作用,同时将C422T突变作为猪抗病育种的一个潜在遗传标记进行系统分析.

关键词：猪、LTβR基因、克隆、真核表达载体、蛋白结构与功能

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分类号：S828;S813.3(家畜)

资助基金：转基因生物新品种培育科技重大专项2014ZX08006-001B;国家自然科学基金31372285,31172183;江苏高校优势学科建设工程资助项目

在线出版日期：2016-09-18（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共11页

页码：2135-2145