水牛YY1基因克隆及其shRNA片段的筛选

摘要：

本试验旨在克隆水牛阴阳因子1(YY1)基因,并筛选获得可有效抑制水牛YY1基因表达的shRNA干扰片段.以水牛成纤维细胞cDNA为模板,采用RT-PCR方法,扩增水牛YY1基因CDS序列,将其连接插入到pMD18-T载体中,进行序列测序并分析.采用Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切,将水牛YY1基因编码区定向克隆至pEG-FP-N1载体中,构建其真核表达载体pYY1-EGFP-N1.设计2条靶向水牛YY1基因的shRNA序列并构建其慢病毒表达载体,命名为pSicoR-GFP-YY1 shRNA1/2.以pSicoR-GFP和pSicoR-GFP-1864分别为空白对照和阴性对照质粒,采用脂质体转染方法,将YY1真核表达载体分别与2条shRNA慢病毒表达载体共转染293T细胞,48 h后观察绿色荧光蛋白EGFP表达情况;72 h收集共转染细胞样品,采用qRT-PCR和Western-blot方法分析YY1基因的表达水平.结果表明,克隆得到1 248 bp的水牛YY1基因CDS序列,其与牛YY1基因的同源性达99％.构建的水牛YY1基因真核表达载体pYY1-EGFP-N1能在水牛胎儿成纤维细胞(BFF)中瞬时表达.酶切分析及序列测定结果表明,所构建的shRNA慢病毒表达载体pSicoR-GFP-YY1 shRNA1/2为阳性克隆.质粒共转染293T细胞48 h后,可观察到绿色荧光蛋白EGFP的表达.qRT-PCR结果显示,设计合成的2条shRNA对水牛YY1基因的表达均有抑制效果,其中YY1 shRNA2的抑制效果(93.64％)显著高于YY1 shRNA1(50.77％) (P＜0.05),Western-blot分析结果显示,2条shRNA对YY1蛋白表达均有抑制效果.以上结果说明克隆得到水牛YY1基因编码区序列,并获得2条有效抑制其表达的shRNA片段,为进一步阐明YY1基因在水牛早期胚胎发育过程中的作用奠定了基础.

关键词：水牛YY1基因、shRNA、慢病毒表达载体、基因表达

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分类号：R65;S82

资助基金：科技部“863”计划项目2011AA100607;广西自然科学基金回国基金重点项目2012GXNSFCB053002;国家留学回国基金项目BLH120499

在线出版日期：2016-09-18（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共7页

页码：62-68