乙型肝炎病毒X蛋白对核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3炎性小体的激活及机制研究

摘要：

目的 探讨乙型肝炎病毒X蛋白(HBx蛋白)对核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)炎性小体活性的影响及其促进HBV相关性肝细胞肝癌(HCC)的作用机制.方法 采用实验研究方法.将HepG2细胞株分为5组:空白对照组(未转染质粒),空载质粒组”转染pE绿色荧光蛋白(GFP)-N1空载质粒”,全长HBx蛋白组(转染pEGFP-N1-X质粒),HBx1-127组(转染pEGFP-N1-X1-127质粒),HBx1-101组(转染pEGFP-N1-X1-101质粒).(1)采用Western blot检测HBx蛋白和NLRP3炎性小体蛋白”采用脂多糖+ ATP干预空白对照组HepG2细胞”的表达.(2)分别采用格列本脲、吡咯烷二硫代甲酸铵盐(APDC)干预全长HBx蛋白HepG2细胞,采用ELISA检测IL-1β和IL-18的表达.(3)采用流式细胞仪检测活性氧的表达.正态分布的计量资料以(x)±s表示,多组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用t检验.结果 (1) Western blot检测结果显示:①空白对照组、空载质粒组、全长HBx蛋白组、HBx1-127组、HBx1-101组HepG2细胞中HBx重组质粒融合蛋白的相对表达量分别为0.07±0.03、0.92 ±0.13、0.84±0.11、0.30±0.06、0.29±0.05,其中HBx1-127组和HBx1-101组HepG2细胞中分别为HBx1-127蛋白和HB1-x101蛋白的表达.5组比较,差异有统计学意义(F =61.790,P＜0.05).其中全长HBx蛋白组分别与空白对照组、HBx1-127组、HBx1-101组比较,差异均有统计学意义(t=12.070,7.465,7.801,P＜0.05);全长HBx蛋白组与空载质粒组比较,差异无统计学意义(t=0.867,P ＞0.05);HBx1-127组和HBx1-101组比较,差异无统计学意义(t=0.146,P＞0.05).②空白对照组、全长HBx蛋白组、HBx1-127组、HBx1-101组、脂多糖±ATP组HepG2细胞中NLRP3炎性小体蛋白的相对表达量分别为0.29±0.06、0.83±0.14、0.27±0.06、0.27±0.05、0.90±0.16,5组比较,差异有统计学意义(F=29.550,P＜0.05).其中脂多糖+ATP组分别与空白对照组、HBx1-127组、HBx1-101组比较,差异均有统计学意义(=6.310,6.565,6.741,P＜0.05);全长HBx蛋白组分别与HBx1-127组、HBx1-101组比较,差异均有统计学意义(t =6.381,6.584,P＜0.05);脂多糖+ATP组与全长HBx蛋白组比较,差异无统计学意义(=0.580,P ＞0.05).(2)ELISA检测结果显示:①空白对照组、全长HBx蛋白组、HBx1-127组、HBx1-101组、脂多糖+ATP组HepG2细胞中IL-1β的表达量分别为(87±9)pg/mL、(587±56) pg/mL、(125±12) pg/mL、(113±13) pg/mL、(677 ±74) pg/mL,IL-18的表达量分另别为(43±8)pg/mL、(252±38) pg/mL、(70±13) pg/mL、(63±10) pg/mL、(263±48) pg/mL.HepG2细胞中IL-1β的表达量5组比较,差异有统计学意义(F=139.010,P＜0.05);其中脂多糖+ATP组分别与空白对照组、HBx1-127组、HBx1-101组比较,差异均有统计学意义(t=13.691,12.752,13.001,P＜0.05);全长HBx蛋白组分别与HBx1-127组、HBx1-101组比较,差异均有统计学意义(t=14.051,14.283,P＜0.05);脂多糖+ATP组与全长HBx蛋白组比较,差异无统计学意义(t=1.691,P＞0.05).HepG2细胞中IL-18的表达量5组比较,差异有统计学意义(F=44.010,P＜0.05);其中脂多糖+ATP组分别与空白对照组、HBx1-127组、HBx1-101组比较,差异均有统计学意义(t =7.848,6.722,7.065,P＜0.05);全长HBx蛋白组分别与HBx1-127组、HBx1-101组比较,差异均有统计学意义(t=7.882,8.331,P＜0.05);脂多糖+ATP组与全长HBx蛋白组比较,差异无统计学意义(t =0.326,P＞0.05).②加格列本脲前、后全长HBx蛋白HepG2细胞中IL-1β的表达量分别为(587 ±91) pg/mL、(115±17) pg/mL,两者比较,差异有统计学意义(t=8.800,P＜0.05).加格列本脲前、后全长HBx蛋白HepG2细胞中IL-18的表达量分别为(243±22) pg/mL、(90±12) pg/mL,两者比较,差异有统计学意义(t=10.566,P＜0.05).加APDC前、后全长HBx蛋白HepG2细胞中IL-1β的表达量分别为(573±89) pg/mL、(124 ±21) pg/mL,两者比较,差异有统计学意义(t=8.516,P ＜0.05).加APDC前、后全长HBx蛋白HepG2细胞中IL-18的表达量分别为(252±24) pg/mL、(116±15) pg/mL,两者比较,差异有统计学意义(t=8.269,P＜0.05).(3)流式细胞仪检测结果显示:空白对照组、全长HBx蛋白组、脂多糖+ATP组HepG2细胞中活性氧的相对表达量分别为66±14、275±54、388±88,3组比较,差异有统计学意义(F=22.130,P＜0.05);其中全长HBx蛋白组和脂多糖+ATP组分别与空白对照组比较,差异均有统计学意义(t=6.489,6.256,P＜0.05);全长HBx蛋白组和脂多糖+ATP组比较,差异无统计学意义(t=1.887,P＞0.05).结论 HBx蛋白通过诱导HepG2细胞内活性氧的产生,进而激活NLRP3炎性小体,可能在HBV相关性HCC的发生发展过程中发挥重要作用.

关键词：肝肿瘤、乙型肝炎病毒X蛋白、核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3炎性小体、活性氧

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资助基金：重庆市自然科学基金2010BA5011Natural Science Foundation of Chongqing 2010BA5011

在线出版日期：2016-07-29（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共7页

页码：615-621