PA K1基因3′-U TR区荧光素酶报告基因载体的构建及鉴定

摘要：

目的：针对人p21小GTP酶活化激酶1（p21‐activated kinase‐1，PAK1）基因的3′端非翻译区（3′‐untranslated region ，3′‐UTR）构建PAK1的荧光素酶报告基因载体，并对其进行鉴定和筛选，为后续 PAK1与microRNA‐145（miR‐145）的功能和机制研究提供实验基础。方法用PCR法扩增出 PAK1基因3′‐U T R片段，经连接、酶切插入到pGL3载体上，构建了 PAK13′‐UTR荧光素酶报告基因载体。通过生物信息学方法预测miR‐145可能靶向作用于PAK1基因的3′‐UTR ，后将上述重组质粒以及miRNA mimics（miRNA模拟物）、miRNA‐Con（miRNA control ，miRNA 阴性对照）瞬转到膀胱癌 T24和J82细胞系中，并检测其相对荧光素酶活性。另外，利用实时定量 PCR法检测不同实验组中 PAK1的表达情况。结果成功构建了重组pGL3‐PAK13′‐UTR WT质粒，并通过双酶切以及测序的方法验证所得结果的正确性。且转染 pGL3‐PAK13′‐UTR WT 质粒后， T24／miR‐145组和J82／miR‐145的相对荧光素酶活性显著低于T24／miR‐con和J82／miR‐con组，差异有统计学意义（P＜0．05）。另外，通过实时定量PCR法发现，miR‐145 mimics组的PAK1表达水平显著低于miR‐145 con组。结论成功构建了PAK1基因3'‐UTR区荧光素酶报告载体，且miR‐145能够显著降低其荧光素酶活性，提示miR‐145能靶向负调控 PAK1的表达。

关键词：p21小GTP酶活化激酶1、3′端非翻译区、荧光素酶报告基因、microRNA-145、膀胱癌

分类号：R737.14(肿瘤学)

资助基金：国家自然科学基金项目．81372279

在线出版日期：2015-08-05（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共5页

页码：415-419