脂质体和慢病毒介导P75神经生长因子受体及神经生长因子转染骨髓间充质干细胞的效果比较
背景:P75神经生长因子受体(P75 neurotrophin receptor,P75NTR)在不同细胞中可以介导截然不同的信号通路,但是在骨髓间充质干细胞中所传导的调节作用还尚未研究;脂质体和慢病毒介导单基因转染细胞技术已趋向成熟,但是其介导双基因转染的差异比较还未见报道.目的:构建大鼠P75NTR、神经生长因子(nerve growth factor,NGF)的过表达质粒及慢病毒载体,比较脂质体和慢病毒介导2种基因转染骨髓间充质干细胞的效果和实用性,以便于今后根据不同实验要求选择实验最优方案.方法:设计大鼠P75NTR及NGF的基因引物,提取基因组DNA进行PCR扩增、与质粒载体重组构建表达增强绿色荧光的GV358-P75NTR、表达增强红色荧光的GV492-NGF过表达质粒,转染293T细胞,加入慢病毒载体超速离心,收集目的基因过表达慢病毒,测定病毒样品滴度;选取体外培养的大鼠原代骨髓间充质干细胞,一组用脂质体Lipo3000共转染质粒GV358-P75NTR、GV492-NGF,另一组用慢病毒共感染,同时设置阴性对照组和空白对照组,对转染后的骨髓间充质干细胞常规培养,第3,5,7,9,12天用荧光显微镜观察红绿荧光的表达,Western blot检测P75NTR及NGF蛋白表达,对转染后培养至7 d的骨髓间充质干细胞进行消化传代培养,培养第3,5,7,9,12天用荧光显微镜观察红绿荧光的表达以及Western blot检测P75NTR、NGF蛋白的表达.结果与结论:①构建的GV358-P75NTR、GV492-NGF过表达质粒及慢病毒符合实验设计;②显微镜视野中红绿色荧光的丰度:脂质体共转染组先增加后降低,慢病毒共感染组持续增多;各时间点慢病毒组均多于脂质体组;脂质体转染组传代培养细胞的荧光表达相比于未传代前降低,而慢病毒转染组未见明显变化;③各时间点慢病毒感染组的P75NTR及NGF蛋白表达量明显高于脂质体组,目的基因转染组的P75NTR及NGF蛋白表达量均高于阴性对照组及空白对照组,差异有显著性意义(P<0.05);④P75NTR、NGF双基因均能通过脂质体和慢病毒共转染方法在大鼠骨髓间充质干细胞中过表达;脂质体双基因转染操作相对简便,实验设备依赖性低,费用相对低廉,但感染效率明显低于慢病毒,而慢病毒双基因共感染后目的基因存在着持续表达,传代后基因丢失现象不明显.
P75神经生长因子受体、神经生长因子、过表达质粒、慢病毒、脂质体、双基因转染、骨髓间充质干细胞、国家自然科学基金
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R459.9;R394.2(治疗学)
国家自然科学基金项目81660366;项目负责人:贝朝涌;广西自然科学基金项目2015GXNSFAA139117
2019-06-13（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
共7页
3302-3308
