pIRES 2-BDNF-VEGF 165真核表达载体的构建与鉴定

摘要：

背景：人脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factor ， BDNF)和血管内皮生长因子165(vascular endothelial growth factor 165，VEGF 165)在细胞分化过程中有重要作用。病毒载体临床应用存在安全隐患，利用真核表达载体表达蛋白为解决安全性问题提供了一种方法。<br>　　目的：构建双基因共表达载体pIRES 2-BDNF-VEGF 165并对其进行鉴定。<br>　　方法：采用PCR的方法从人外周血单个核细胞的基因组DNA中获取人脑源性神经营养因子基因，然后将人脑源性神经营养因子的cDNA片段插入到pIRES 2-EGFP多克隆位点构建为pIRES 2-BDNF-EGFP。人血管内皮生长因子165 cDNA片段是通过双PCR的方法从pIRES 2-VEGF 165-EGFP质粒中获取，接着将血管内皮生长因子165 cDNA片段以替换 EGFP 的方式插入pIRES 2-BDNF-EGFP中，最后构建成为含有即内部核糖体进入位点的pIRES 2-BDNF-VEGF 165双基因共表达载体。通过双酶切和 DNA测序方法对其鉴定，将重组的双基因共表达载体感染HEK293细胞，利用 RT-PCR 与Western-blot 方法检测双基因的表达。<br>　　结果与结论：DNA测序显示，提取的人脑源性神经营养因子和血管内皮生长因子165均与基因库报道序列一致，片段长度分别为744 bp和576 bp。构建的pIRES 2-BDNF-VEGF 165双基因共表达载体经Eco RⅠ/Bam HⅠ切出BDNF条带，经BDNF/NotⅠ双酶切后可见 IRES-VEGF 165基因片段，经 Eco RⅠ/NotⅠ双酶切后可见BDNF-IRES-VEGF165基因片段。RT-PCR 与Western-blot 方法检测显示，此载体转染后，HEK293细胞均能表达人脑源性神经营养因子和血管内皮生长因子165 mRNA和蛋白。结果证实，实验成功构建了人脑源性神经营养因子和血管内皮生长因子165双基因真核表达载体。

关键词：组织构建、组织构建基础实验、脑源性神经营养因子、血管内皮生长因子165、真核双表达载体、内部核糖体进入位点、转染、双PCR、省级基金

分类号：R318(医用一般科学)

资助基金：实验由新乡医学院重点领域招标课题ZD2011-16；河南省教育厅科学技术研究重点项目13A180850共同资助@@@@the Tender Subject of Key Research Areas of Xinxiang Medical Uuniversity in 2011, No. ZD2011-16;Key Projects in Scientific Research of Henan Provincial Education Department, No.13A180850

在线出版日期：2013-12-24（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共10页

页码：8719-8728