人Leptin基因融合蛋白表达载体构建及对人成骨细胞的作用

摘要：

背景:瘦素作为一种内分泌激素参与机体能量代谢的调节,近年来瘦素对骨代谢的调节作用也越来越被人们所重视.目的:克隆人Leptin基因,构建重组原核表达载体PEGX-5X-3/Leptin并在大肠杆菌中表达,观察Leptin融合蛋白对人成骨细胞的生长抑制作用.设计、时间及地点:单一样本观察,于2007-07/2008-05在苏州大学附属第一医院骨科实验室完成.材料:新鲜的脂肪组织取自苏州大学附一院(供者知情并同意)、大肠杆菌DH5а、人成骨细胞由苏州大学附属第一医院骨科实验室保种.方法:从人脂肪组织中提取RNA,采用反转录-聚合酶链式反应获得人Leptin全部序列,克隆入带有GST原核细胞表达载体PEGX.5X-3中,实现插入基因的融和表达,用SDS.PAGE和Western Blot对表达产物进行鉴定,提取并纯化GST-Leptin融合蛋白,以5,10,20,40 mg/L不同质量浓度与人成骨细胞共培养,同时设立相应浓度梯度的GST蛋白组,四甲基偶氮唑盐法测两组人成骨细胞的体外增殖情况.主要观察指标:①Leptin 基因的克隆与鉴定.②重组质粒的双酶切及聚合酶链反应鉴定.③融合蛋白的表达.④GST-Leptin融合蛋白的纯化.⑤GST-Leptin融合蛋白的鉴定.⑥GST-Leptin融合蛋白对人成骨细胞的生长影响.结果:反转录-聚合酶链反应扩增得到的特异性片段长度约为450 bp,以此构建的重组质粒PEGX-5×-3/Leptin,经BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切后显示5 kb和450 bp左右的两条片段.测序结果与Genbank中报道的完全一致,证明Leptin基因已成功地克隆到了原核表达载体PEGX-5×-3中.并在大肠杆菌中获得稳定的表达,表达产物的相对分子质量(Mr)同预期值相一致,融合蛋白为M 45 000,GST蛋白为Mr29 000,与GST蛋白组相比,20,40 mg/L的GST-Leptin融合蛋白可以明显促进细胞的生长(P<0.05),且其促进作用有一定的浓度依赖性.结论:成功构建了PEGX-5X-3/Leptin重组原核表达载体,在E.coil BL21中表达GST-Leptin融合蛋白,并以浓度依赖性促进人成骨细胞的生长.

关键词：瘦素、基因表达、成骨细胞

所属期刊栏目：13

分类号：R329(人体形态学)

资助基金：江苏省"科教兴卫"工程项目RC2007078

在线出版日期：2009-04-21（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共5页

页码：1232-1236