Ⅰ型变链素基因片段原核表达的构建

摘要：

目的:获得编码变形链球菌CH43变链素Ⅰ前体肽基因片段,构建Ⅰ型变链素的原核表达载体,优化表达条件.方法:实验于2004-09/2005-06在解放军第四军医大学秦都口腔医院牙体牙髓病实验室地点完成.①实验材料:streptococcus Mutan CH43菌株由Dr.P.g.Caufield惠赠.E.coliTOP10 E.coli DH5α及表达载体pProEX由秦都口腔医院牙体牙髓病实验室保存.②实验过程:厌氧条件下培养变形链球菌CH43,通过碱裂解法得到其基因组DNA.利用聚合酶链反应技术从变形链球菌CH43基因库中扩增出编码变链素Ⅰ前体肽mutA基因片段相应大小的DNA片段,将片段与pMD18-T载体连接后测序以检测序列正确性.将测序正确的Ⅰ型变链素mutA按照BamHI和HindIII酶切位点克隆人原核表达载体pProEX-HTb,将连接产物转化入Ecoli DH5α,挑出阳性克隆,以A600从0.406～1.666七个不同浓度,异丙基β-D硫代半乳糖苷(终浓度设成1.0,1.4,1.8,2.0,2.5 mmol/L 5个梯度)诱导表达重组的带有6个组氨酸标签的融合蛋白,诱导时间分别3,6,18 h.③实验评估:观察mutA片段的扩增及序列测定结果;表达载体的构建结果;融合蛋白在大肠杆菌中的表达及表达条件的优化.结果:①聚合酶链反应获得的mutA序列与GenBank报道的一致(为147 bp).②Ⅰ型变链素的mutA基因片断被成功克隆入原核表达载体pProEX-HTb中,在A600达到1.000以上,异丙基β-D硫代半乳糖苷终浓度1.2 mmol/L,30℃诱导6 h,蛋白表达量较佳,稳定可重复.结论:成功克隆变形链球菌CH43变链素Ⅰ mutA基因片段,构建表达了Ⅰ型变链素的融合蛋白.

关键词：链球菌、变异、龋齿、基因表达、克隆、分子

所属期刊栏目：11

分类号：R378.1(医学微生物学（病原细菌学、病原微生物学）)

在线出版日期：2008-03-03（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共3页

页码：9316-9318