血管内皮细胞生长因子受体KDR基因靶向RNA干扰质粒的构建

摘要：

目的:应用RNA干扰技术设计构建针对血管内皮细胞生长因子受体KDR的小干扰RNA,并观察脂质体转染肺癌细胞A549后的干扰效果.方法:实验于2005-03/2006-01在沈阳医学院生物化学及分子生物学教研室完成.①设计针对KDR编码区有短发夹结构的3条mRNA序列,经退火成互补双链,克隆到pGCsi.H1/neo/GFP载体中构建3个重组质粒,分别命名为KDR-siRNA1、KDR-siRNA2和KDR-siRNA3.②设立5组:小干扰RNA组,分别转染KDR-siRNA1、KDR-siRNA2和KDR-siRNA3;阳性对照组,转染pGCsi.H1/neo/siGFP,该质粒载体中的插入序列为针对绿色荧光蛋白的小干扰RNA,不干扰待研究的内源性基因;阴性对照组,转染pGCsi.H1/neo/GFP/NON,该载体为不干扰任何内源性基因的小干扰RNA;空白对照组,转染pGCsi.H1/neo/GFP空载体;正常对照组,不进行任何转染.③对重组质粒进行酶切鉴定、DNA测序分析;脂质体法转染质粒至肺癌A549细胞株后,实时定量PCR检测KDR mRNA的水平变化;细胞计数法绘制细胞生长曲线.结果:①小干扰RNA表达载体的鉴定:KDR-siRNA1、KDR-siRNA2和KDR-siRNA3表达载体用限制性内切酶NdeⅠ和SmaⅠ进行单酶切后,均产生约713 bp、5 480 bp和2 403 bp、3 790 bp两个片段,与预期结果相同.测序结果与设计的编码相应短发夹状KDR-小干扰RNA的寡核苷酸序列一致,证明KDR-小干扰RNA真核表达载体构建成功.②KDR-小干扰RNA对A549细胞中KDR mRNA水平的影响:与阳性对照组、阴性对照组、空白对照组和正常对照组的A549细胞相比,KDR-siRNA1,2,3表达载体转染后的A549细胞KDR基因表达水平均明显受到抑制,抑制率分别为64%、81%和72%,其中以KDR-siRNA2抑制作用最为明显.③KDR-小干扰RNA对A549细胞生长的影响:阳性对照组、阴性对照组、空白对照组、正常对照组的A549细胞生长趋势较为一致,且生长速度均明显高于转染3种KDR-小干扰RNA表达载体的A549细胞,从接种第2天开始差异有显著性意义(t=15.29～17.65,P均＜0.01).结论:血管内皮细胞生长因子受体KDR靶向RNA干扰重组质粒构建成功,该载体能有效抑制肺癌A549细胞KDR基因表达与细胞增殖.

关键词：KDR、RNA干扰、定量PCR、细胞增殖

所属期刊栏目：11

分类号：R392.2

资助基金：沈阳医学院重点支持项目200411

在线出版日期：2007-08-06（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共4页

页码：5303-5306