微波辐照对血管内皮细胞转录因子NF-E2相关因子2磷酸化及蛋白激酶C活性的影响

摘要：

背景:转录因子NF-E2相关因子2是细胞调节抗氧化应激反应的重要转录因子,有实验表明转录因子NF-E2相关因子2能被蛋白激酶C家族中的众多成员磷酸化,为进一步研究微波辐射造成氧化应激损伤的产生机制,是否可以从转录因子NF-E2相关因子2途径观察微波辐照对抗氧化调控系统的影响?目的:分析微波辐照对血管内皮细胞转录因子NF-E2相关因子2的磷酸化及蛋白激酶C活性的影响.设计:观察对比实验.单位:解放军第三军医大学劳动卫生学教研室.材料:血管内皮细胞株,H332PO4,Protein-A Sepharose(Sigma公司),转录因子NF-E2相关因子2单抗(H-300,Santa Cruz),蛋白激酶Cα单抗(Santa Cruz),玻纤滤膜(Whatman公司)凝胶扫描系统(Gel Doc 2000,Bio-Rad),液闪测定仪(LKB-117瑞典).方法:实验于2003-03/07在解放军第三军医大学劳动卫生学教研室电磁辐射生物效应研究室完成.①转录因子NF-E2相关因子2磷酸化分析:血管内皮细胞以DMEM培养液培养至细胞生长至旺盛期,加入32Pi孵育标记2 h,将细胞培养瓶置于37℃水浴盒中,在反射系数近似零的微波暗室接受微波辐照,为辐照组,辐照平均功率密度为30 mW/cm2,辐照时间30 min;以未接受辐照的细胞为对照组.采用免疫共沉淀-放射自显影法测定转录因子NF-E2相关因子2磷酸化水平,用凝胶扫描系统对细胞转录因子NF-E2相关因子2磷酸化水平进行半定量分析,对照组细胞直接进行分析.②蛋白激酶C蛋白激酶活性分析及表达量测定:辐照组及对照组细胞培养方法、条件,辐照方式、剂量、条件同前.于辐照后2,4,8,24 h裂解细胞,提取胞浆和胞膜蛋白,采用r-32P-ATP标记液闪法进行蛋白激酶C活性测定;采用凝胶扫描系统对蛋白条带灰度进行半定量分析;对细胞进行蛋白激酶C免疫细胞化学染色后于光镜下观察细胞胞浆的着色程度,对照组均直接给予测定和观察.主要观察指标:①辐照组及对照组转录因子NF-E2相关因子2磷酸化水平检测结果.②细胞蛋白激酶活性分析及表达量测定结果.结果:①辐照组及对照组转录因子NF-E2相关因子2磷酸化水平测定结果:辐照组辐照后2,4,8 h,转录因子NF-E2相关因子2条带灰度强于对照组细胞,辐照4 h,转录因子NF-E2相关因子2磷酸化达到峰值水平,条带灰度扫描半定量分析显示辐照2,4,8 h辐照组细胞转录因子NF-E2相关因子2磷酸化水平较对照组分别增加33%,261%,141%(t=2.974,4.209,4.047,P＜0.05),24 h恢复正常.②辐照组及对照组细胞蛋白激酶C表达量及活性检测结果:微波辐照2,4,8 h,辐照组细胞蛋白激酶C表达量高于对照组,以4 h最明显,辐照后24 h恢复正常;免疫细胞化学染色显示辐照组细胞辐照4 h胞浆着色强度强于对照组;r-32P-ATP标记液闪法显示辐照2,4,8 h,辐照组细胞蛋白激酶C活性较对照组分别增加了36%,93%,47%(t=2.801,3.654,3.035,P＜0.05),24 h有回落.蛋白激酶C激活的峰值发生在照射后4 h.结论:微波辐照可引起血管内皮细胞转录因子NF-E2相关因子2磷酸化水平在一定时段内增强,同时可引起细胞蛋白激酶C表达增加,其活性变化时间效应与转录因子NF-E2相关因子2磷酸化水平有一致性.

关键词：微波、血管内皮、细胞、转录因子、蛋白激酶C

所属期刊栏目：11

分类号：R35(人体生物物理学)

资助基金：国家自然科学基金30270348

在线出版日期：2007-07-02（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共4页

页码：2765-2768