诱导人骨髓间充质干细胞向肝系细胞分化过程中肝细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的作用

摘要：

背景:骨髓间充质干细胞是一种存在于骨髓内的非造血干细胞,因其具有自我更新能力及多向分化潜能,且分离培养方法成熟,在组织器官修复及再生方面显示出良好的应用前景,将为终末期肝病的治疗如生物人工肝及肝细胞移植提供新的细胞来源,但目前人骨髓间充质干细胞向肝系细胞诱导分化培养体系尚不成熟.目的:观察肝细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子联合应用诱导人骨髓间充质干细胞在体外向肝系细胞分化的可能性.设计:开放性实验.单位:南昌大学第一附属医院传染科与泌尿外科研究所.材料:实验于2004-07/2005-03在南昌大学第一附属医院泌尿外科研究所完成.所用骨髓由成年健康志愿者提供(均对本实验知情同意).DMEM/F12培养基(Gibco公司);表皮细胞生长因子,肝细胞生长因子,胰岛素,转铁蛋白,鼠抗人甲胎蛋白单克隆抗体,FITC-兔抗鼠IgG(Sigma公司);碱性成纤维细胞生长因子(Invitrogen公司);鼠抗人角蛋白18,19单克隆抗体(Chemicon公司);胎牛血清(杭州四季青).方法:以骨髓腔穿刺方式抽取成年健康志愿者髂后上棘处骨髓10 mL,采用密度梯度离心法分离和反复贴壁法纯化骨髓间充质干细胞.取培养至4～8代细胞,消化后以107 L-1接种到放置20 mm×20 mm爬片的预先铺被有0.1%明胶的24孔板中,次日换液,改用无血清DMEM/F12培养基(含20 μg/L的表皮细胞生长因子和10 μg/L的碱性成纤维细胞生长因子)培养2 d后,换成无血清DMEM/F12培养基(含20 μg/L的肝细胞生长因子,10 μg/L的碱性成纤维细胞生长因子,5 mg/L的胰岛素,5 mg/L的转铁蛋白)进行诱导分化,每3 d换液1次,以未加入肝细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的骨髓间充质干细胞作为对照组.骨髓间充质干细胞诱导培养过程中,放射免疫荧光法测甲胎蛋白浓度.诱导当天及第7,14,21,28天,取诱导细胞爬片,细胞免疫荧光法检测肝细胞表面标志物甲胎蛋白、角蛋白18和角蛋白19的表达,并进行糖原染色检测诱导细胞的糖原合成情况.主要观察指标:(①细胞形态学观察.②培养上清液中甲胎蛋白表达量的测定.③肝细胞表面标志检测结果.④诱导细胞的糖原合成情况.结果:①诱导第14天可观察到细胞变成短梭形和多角形,随培养时间的延长多角形细胞增多,并可形成肝细胞样的细胞集落.②诱导第14天培养上清液内可检测到甲胎蛋白的分泌,每孔浓度为0.1 μg/L;第17天达高峰0.4 μg/L;第21天下降至0.3 μg/L.③诱导第14天甲胎蛋白、角蛋白18表达呈阳性,第28天角蛋白19表达呈阳性.④诱导第21天糖原染色呈阳性反应.结论:肝细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子能够诱导入骨髓间充质干细胞在体外向肝细胞分化,表达肝细胞特异性表面标志,并具有合成糖原、分泌甲胎蛋白的功能.

关键词：间质干细胞、骨髓细胞、肝细胞、细胞分化、细胞培养技术

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分类号：R3(基础医学)

资助基金：Jiangxi Science and Technology Bureau;江西省科技厅科技攻关项目

在线出版日期：2007-04-17（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共4页

页码：1397-1400