shAkt2慢病毒表达载体的构建及其对H292细胞增殖和凋亡的影响

摘要：

目的 构建shAk2基因慢病毒表达载体,获得稳定干扰Akt2基因的细胞克隆,建立靶向沉默Akt2的非小细胞肺癌稳定细胞株,并探讨Akt2基因在非小细胞肺癌中的作用.方法 根据shRNA干扰序列设计原则,设计并合成针对Akt2靶基因的双链寡核苷酸序列,经退火、酶切、连接反应,将干扰序列插入pLKD.CMV.GFP.U6质粒,经感受态细胞转化、阳性克隆测序鉴定所插入的片段,抽提重组质粒及辅助包装元件载体质粒p-Helper1.0和p-Helper2.0,通过阳离子脂质体lipofectemin2000介导细胞转染及慢病毒包装,收集浓缩病毒进行滴度测定,感染至人肺腺癌细胞H292,通过无菌流式细胞分选GFP强阳性细胞,应用Western-blot验证干扰效果.CCK-8比色法检测细胞增殖,Annexin V.FITC/PI双染法检测细胞凋亡.结果 与正常对照组比较,shAkt2组细胞中Akt2蛋白水平减少90.89％,提示靶向抑制Akt2的慢病毒shRNA表达载体构建成功,并获得稳定抑制Akt2基因表达的细胞克隆.CCK-8法检测细胞增殖能力,shAkt2组细胞在48h,72h,96h及120h的吸光度值明显减低(P＜0.05),干扰Akt2基因表达后显著抑制细胞增殖速率.采用Annexin-V/7-AAD流式细胞分析法检测各组中凋亡细胞的比例,shAkt2组凋亡率显著高于NC及NSCLC组(P＜0.05).结论靶向干扰Akt2基因表达可抑制肺腺癌细胞株H292细胞的增殖能力,促进其凋亡.

关键词：非小细胞肺癌、Akt2慢病毒载体、细胞增殖、凋亡

所属期刊栏目：28

分类号：R373(医学微生物学（病原细菌学、病原微生物学）)

资助基金：国家自然科学基金81372504;四川省卫计委重点学科科研课题150092;川北医学院科研发展计划重点培育项目CBYI3-A-ZP23

在线出版日期：2016-04-12（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共6页

页码：22-27