甲基CpG结合蛋白2(MeCP2)遏制HEK293细胞甲基化修饰的IL-6启动子活性及其分子机制
目的 在HEK293细胞甲基化修饰白细胞介素6(IL-6)启动子序列并过表达甲基CpG结合蛋白2(MeCP2)以及转录因子P300,探讨MeCP2抑制IL-6转录活性的分子机制.方法 通过电泳迁移率实验(EMSA)对P300 IL-6启动子区域的P300结合位点进行验证,IL-6启动子序列连接于荧光素酶报告质粒并转染HEK293细胞,同时利用规律间隔的成簇短回文重复序列-去活性Cas9核酸酶-DNA甲基转移酶3A(CRISPR-dCas9-DNMT3A)转染介导启动子的甲基化修饰,再转染MeCP2以及P300过表达质粒.亚硫酸氢盐测序PCR分析各组IL-6启动子区域胞嘧啶甲基化修饰情况;Western blot法检测胞内MeCP2、P300蛋白水平;通过化学发光检测仪测定HEK293荧光素酶活性,并结合染色质免疫沉淀-测序技术(ChIP-seq)分析各组P300以及MeCP2在IL-6启动子区域的结合水平.结果 EMSA证实小鼠IL-6启动子部位存在P300结合位点;CRISPR-dCas9-DNMT3A转染HEK293细胞能够成功甲基化小鼠IL-6启动子;MeCP2以及P300过表达质粒能够稳定合成目标蛋白,且不受其他转染影响.相比于未被修饰的启动子,甲基化修饰可降低启动子转录活性,且于P300过表达情况下,较之单纯甲基化修饰,过表达MeCP2还将进一步遏制启动子转录活性.此外,甲基化修饰的启动子与MeCP2结合后,过表达P300未提升启动子转录活性;而在其他转染条件下,过表达P300均能促进转录活性.Chip-seq分析进一步表明,启动子的甲基化修饰并不干扰P300结合;然而甲基化修饰的启动子与MeCP2结合后,P300与启动子的结合则受到抑制.结论 MeCP2与甲基化修饰的IL-6启动子相结合,可阻遏转录因子与启动子结合,从而进一步抑制启动子的转录活性.
甲基CpG结合蛋白2(MeCP2)、甲基化、白细胞介素6(IL-6)、启动子、转录活性
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R392.12;R392-33;R373.1;R364.5
国家自然科学基金82070081
2022-06-21（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
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