表达Panton-Valentine杀白细胞素(PVL)的金黄色葡萄球菌诱导人THP-1单核细胞自噬和凋亡
目的 研究表达Panton-Valentine杀白细胞素(PVL)的金黄色葡萄球菌诱导人THP-1细胞自噬和凋亡机制.方法 在大肠杆菌中表达重组杀白细胞素(rPVL),并免疫家兔制备多克隆抗血清.采用反转录PCR和Western blot法鉴定表达PVL的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA).分别使用表达PVL的MRSA(MRSAPVL+)和不表达PVL的MRSA(MRSAPVL-)感染THP-1细胞,于感染后1、3、6h收集细胞,采用实时定量PCR检测自噬相关基因3(ATG3)、ATG4B、ATG5、ATG7、ATG12;Western blot法检测beclin-1、微管相关蛋白1轻链3(LC3)、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、磷酸化的PI3K(p-PI3K)、蛋白激酶B(AKT)、磷酸化的AKT(p-AKT)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、磷酸化的mTOR(p-mTOR)、裂解型胱天蛋白酶3(c-caspase-3)、caspase-3的蛋白水平;二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)荧光探针负载法检测细胞活性氧(ROS)水平;异硫氰酸荧光素标记的膜联素V/碘化丙啶(annexin V-FITC/PI)双标记结合流式细胞术检测细胞凋亡.结果 成功制备PVL多克隆抗体,鉴定出1株MRSAPVL-菌和1株MRSAPVL+菌.分别以两株菌与THP-1细胞共培养1h,MRSAPVL+组仅ATG7表达量显著高于MRSAPVL-组和正常对照组;共培养3h,MRSAPVL+组ATG7和ATG12表达量高于MRSAPVL-组和正常对照组,其他基因表达量变化不明显.感染1、3、6h,MRSAPVL+感染组细胞PI3K、AKT和mTOR磷酸化水平显著低于MRSAPVL-感染组和正常对照组;感染1h和3h,MRSAPVL-感染组细胞PI3K、AKT和mTOR磷酸化水平显著低于正常对照组;感染6h,MRSAPVL-菌感染组细胞mTOR磷酸化水平显著低于正常对照组.感染1、3、6h,MRSAPVL+组细胞ROS水平和凋亡率均高于MRSAPVL-组和正常对照组,且随着感染时间的延长细胞ROS水平和凋亡率持续增加;MRSAPVL-组细胞ROS水平和凋亡率也高于正常对照组.结论 MRSAPVL+对THP-1细胞PI3 K/AKT/mTOR信号通路抑制作用更强,可促进ATG12/ ATG7/ATG5自噬通路活化增加THP-1细胞自噬;同时,MRSA PVL诱导THP-1细胞ROS产生增加,促进细胞凋亡.
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、Panton-Valentine杀白细胞素(PVL)、巨噬细胞、自噬、凋亡
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R378.1+1;R392.12;Q255(医学微生物学（病原细菌学、病原微生物学）)
2020年度镇江市社会发展指导性科技计划FZ2020037
2021-07-13（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
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