抗B7-H4单链抗体库的构建和筛选及抗体特异性鉴定

摘要：

目的 构建小鼠抗B7-H4胞外区核糖体展示单链抗体(scFv)库,并筛选出特异性高的抗体.方法 从A549细胞的cDNA中扩增B7-H4胞外区基因,将其插入原核表达载体pET-28a(+)中表达,获得B7-H4胞外区重组蛋白后纯化并免疫BALB/c小鼠.从免疫小鼠脾脏中提取总RNA,并利用反转录PCR、重叠延伸PCR(SOE-PCR)等技术扩增出重链可变区(VH)、轻链可变区(Vκ)、VH接头(VH-linker)序列和Vκ接头(Vκ-linker)序列,得到重轻链可变区基因的连接产物VH/Vκ.VH/Vκ与pUM19-T载体连接并转化至E.coli DH5α感受态菌株中,利用菌落PCR技术鉴定并测序.使用TNT(R) T7 Quick for PCR DNA试剂盒对构建出的抗体库进行体外翻译与筛选,采用Western blot法和间接ELISA对得到的抗体进行特异性鉴定.结果 经生物公司测序分析,得到序列正确的重链可变区(VH)、轻链可变区(Vκ)及二者连接产物(VH/Vκ),大小分别为439 bp、680 bp及1098 bp.经特异性实验分析,从得到的抗体库中筛选出的抗体与B7-H4具有高特异性结合能力.结论 成功构建出鼠抗B7-H4胞外区核糖体展示scFv库,并筛选出与B7-H4胞外区重组蛋白高特异性结合的目标scFv.

关键词：B7-H4、胞外区、单链抗体、核糖体展示、重组蛋白

所属期刊栏目：32

分类号：R392.11;R392-33

资助基金：江苏省教育厅自然科学基金08KJD35002

在线出版日期：2016-10-17（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页码：1260-1266