人八聚体结合蛋白4(Oct4)cDNA的克隆及其在大肠杆菌和HEK293T细胞的表达
目的 克隆人八聚体结合蛋白4 (Oct4) cDNA,研究其在原核及真核系统中的表达.方法 提取人宫颈癌HeLa细胞中的总RNA,经反转录PCR获得cDNA,PCR扩增Oct4 cDNA并将其分别克隆入表达载体pET-22b(+)原核质粒和pcDNATM3.1(+)真核质粒,构建含该序列的重组原核表达载体pET42b(+)-Oct4和真核表达载体pcDNA3.1(+)-his-Oct4.然后分别进行双酶切和测序鉴定.前者在E.coli BL21(DE3)中诱导表达目的蛋白,后者以脂质体介导法转染至HEK293T细胞,SDS-PAGE和Western blot法检测细菌和细胞中OCT4蛋白的表达水平.结果 PCR扩增得到约1100 bp目的DNA片段;重组表达质粒pET-22b(+)-Oct4和pcDNA3.1(+)-his-Oct4经双酶切鉴定和测序分析证明载体构建成功;pET-22b(+)-Oct4经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达后SDS-PAGE分析表明,目的蛋白在宿主E.coli BL21(DE3)中高效表达OCT4融合蛋白,相对分子质量(Mr)约38 000,与其理论M基本相符;pcDNA3.1(+)-his-Oct4转染HEK293T细胞经Western blot法检测,证实导入的Oct4成功表达.结论 在大肠杆菌和HEK293T细胞成功表达OCT4蛋白.
Oct4基因、分子克隆、原核表达、真核表达
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Q785;Q786(基因工程（遗传工程）)
广东省海洋渔业局项目GD2012-D01-002,A1201301C06;广东省科技计划项目2015A020211036;广州市科技计划2014J4100058
2016-04-15（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
308-312
