中性粒细胞弹性蛋白酶的过表达促进K562细胞增殖并抑制其凋亡
目的 利用AdEasy系统构建携带人中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)基因的重组腺病毒表达质粒,并感染K562细胞,观察其对K562细胞增殖和凋亡的影响.方法 以急性早幼粒细胞白血病(APL)细胞株HL-60的RNA为模板,经反转录PCR得到NE基因的编码区并克隆入穿梭载体pAdTrack-CMV,得到pAd-NE,经HindⅢ、EcoR V酶切鉴定和测序正确后,将其转化入pAdEasy-1-BJ5183进行同源重组,得到重组子Ad-NE,经PacⅠ酶切线性化后转染AD293细胞进行包装.14 d之后收获原代病毒,经5轮扩增后,测定病毒滴度,进行PCR鉴定.感染K562细胞后,荧光显微镜初步观察感染效率,同时用流式细胞术检测感染效率;Western blot法进一步鉴定NE是否表达上调;CCK-8法测定细胞增殖情况;流式细胞术测定细胞凋亡和细胞周期变化.结果 酶切鉴定及测序结果表明重组穿梭质粒pAd-NE构建成功;酶切鉴定显示同源重组成功,得到重组子Ad-NE;荧光显微镜表明病毒包装成功;经过5轮扩增后,病毒滴度达到1.64×1012 pfu/mL;感染K562细胞后,荧光显微镜观察感染效率达80％左右;Western blot法检测到NE表达上调;CCK-8实验显示NE表达上调后K562细胞增殖能力增强;流式细胞术显示S期细胞明显增多并且细胞凋亡减少.结论 过表达NE可促进K562细胞增殖并抑制其凋亡.
中性粒细胞弹性蛋白酶、重组腺病毒、增殖、凋亡、K562细胞
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R392-33;Q279;Q255
国家自然科学基金81171658;重庆市自然科学基金计划重点项目2011BA5037
2015-04-02（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
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