miRNA-144抑制小鼠RAW264.7巨噬细胞ABCA1表达
目的 构建miR-144真核表达载体,检测miR-144是否调控小鼠RAW264.7巨噬细胞三磷酸腺苷结合盒转运体A1(ABCA1)的表达.方法 结合文献,通过预测软件分析,选取评分较高、可作用于ABCA1 mRNA 3 '非编码区(ABCA1 mRNA 3'UTR)的miR-144.通过分子克隆技术,利用PCR扩增miR-144和ABCAI mRNA 3'UTR的DNA序列,酶切胶回收后,分别连接至真核表达载体pcDNA3.1(+)载体和pcDNA3.1(+)-luciferase载体上.测序后,运用双荧光素酶报告基因系统检测萤火虫荧光素酶的活性,观察miR-144是否对ABCA1 mRNA 3'UTR具有直接靶向作用.运用LipofectaminTM 2000将pcDNA3.1(+)空载体、pcDNA3.1 (+)-miR-144转染至小鼠RAW264.7巨噬细胞.通过实时定量PCR(qRT-PCR)检测转染后miR-144的表达含量.通过qRT-PCR和Western blot法检测过表达miR-144后ABCA1在mRNA和蛋白水平的变化.结果 miR-144 PCR产物连接至pcDNA3.1(+)载体上,ABCA1 mRNA 3'UTR连接至pcDNA3.1(+)-luciferase载体上,测序正确.运用双荧光素酶报告基因系统检测发现,和对照组[pcDNA3.1(+)空载体、pcDNA3.1(+)-luciferase-ABCA1 3 ' UTR和PRL-SV40联合转染]三者相比,实验组[pcDNA3.1(+)-miR144、pcDNA3.1(+)-luciferase-ABCA1 3'UTR和PRL-SV40联合转染]三者可以显著降低萤火虫荧光素酶的活性(P＜0.05),证明miR-144对ABCA1 mRNA 3'UTR具有直接靶向作用.将pcDNA3.1(+)空载体、pcDNA3.1(+)-miR-144转染至小鼠RAW264.7细胞中,qRT-PCR结果显示,转染pcDNA3.1(+)空载体组miR-144表达无明显变化(P＞0.05);转染pcDNA3.1(+)-miR-144组中miR-144表达量显著增高(P＜0.01).qRT-PCR结果显示,转染pcDNA3.1(+)空载体和pcDNA3.1(+)-miR-144对ABCA1 mRNA表达水平无明显影响(P＞0.05),Western blot结果显示转染pcDNA3.1(+)-miR-144可以显著降低ABCA1蛋白水平的表达(P＜0.01).结论 miR-144可以在转录后水平降低ABCA1蛋白的表达.
miR-144、三磷酸腺苷结合盒转运体A1、巨噬细胞、RAW264.7细胞
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Q782;R392-33;Q524+.3(基因工程（遗传工程）)
重庆医科大学研究生课题经费2012-2013年;国家临床重点专科建设项目2011年
2014-09-24（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
951-955
