Kinase-Glo激酶发光法体外测定蛋白激酶A活性

摘要：

目的:建立一种简便、无害的体外测定PKA激酶活性的非放射性核素方法.方法:采用RT-PCR方法从HEK293细胞的总RNA中扩增PKAα的cDNA,并将PKAα的cDNA克隆至pGEX-6p-1载体中.经纯化后的体外表达蛋白用免疫印迹(Western blot)法进行鉴定.最后采用非放射性核素法Kinase-Glo激酶发光检测试剂盒测定表达蛋白GST-PKAα的活性.结果:经过优化诱导条件,我们成功地纯化得到了GST-PKAα的融合蛋白.用非放射性核素法Kinase-Glo激酶发光检测试剂盒测定纯化蛋白GST-PKAα活性.我们还用PKA特异性抑制剂H-89进一步确定了表达蛋白GST-PKAα的活性,并且测定了其IC50值为(35.2±3.97) nmol/L,与报道值一致.结论:Kinase-Glo激酶发光检测法测定PKA激酶活性,操作简便、对人体无害.此方法能有效应用于临床前PKA激酶抑制剂的高通量筛选、PKA激酶新作用靶点的发现以及靶向蛋白PKA磷酸化位点的研究.

关键词：蛋白激酶A、GST融合蛋白、蛋白纯化、磷酸化、高通量筛选

所属期刊栏目：28

分类号：Q-331;Q754(生物科学的研究方法与技术)

在线出版日期：2012-09-29（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页码：684-687