重组Trail蛋白在大肠杆菌中的表达及纯化条件的优化
目的:构建肿瘤坏死因子相关凋亡配体胞外功能区的原核表达质粒,优化诱导蛋白表达的相关条件,检测切胶纯化所得蛋白的抗原结合活性,以及亲和层析纯化蛋白的促凋亡功能.方法:扩增Trail胞外功能区第114 - 281个氨基酸基因序列,插入融合表达载体pET-28α(+)的多克隆位点,构建重组表达质粒pET-28α(+)-Trial114 -281.以重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),筛选阳性重组子,调整诱导前菌群的密度(A600)值,诱导时IPTG的浓度、温度及诱导时间,确定最佳诱导条件,同时比较超声、渗透冲击和IP裂解三种破碎细菌方法以及切胶回收和Ni-NTA亲和层析方法对纯化目的蛋白的影响.Western blot鉴定切胶纯化蛋白的抗原结合活性,用Ni-NTA亲和层析方法得到的蛋白作用于A549细胞,采用流式细胞术检测检测该细胞的凋亡率.结果:成功扩增了Trail胞外区基因序列,经测序证实其正确插入到表达载体pET-28α(+)中,经IPTG诱导,在37℃时呈包涵体表达,25℃时为可溶性表达,经软件分析确定A600 =0.6,IPTG终浓度为0.6 mmol/L,诱导4h为包涵体表达的最佳条件；A600 =1.0,IPTG1.0 mmol/L,诱导4h为可溶性目的蛋白表达的最佳诱导条件.三种破菌方法的比较,超声法获得的蛋白最多.切胶和Ni-NTA亲和柱纯化的方法都得到了目的蛋白,Western blot分析显示,切胶纯化的蛋白有较好的抗原结合活性,亲和层析得到的可溶性蛋白可以促使A549细胞发生凋亡.结论:成功构建了重组表达载体pET28α-Trial114 -281,在A600值、IPTG 以及诱导时间都相同的情况下,37℃出现包涵体表达,而25℃则出现了可溶性表达.切胶纯化获得蛋白有较好的抗原结合活性,亲和层析纯化的可溶性蛋白能保持其原有的功能不被破坏,促使肿瘤细胞A549的凋亡.
pET-28α-Trail114-281、优化条件、目的蛋白、纯化
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Q78(基因工程（遗传工程）)
第三轮广州市属高校重点学科建设经费资助稳教高教[2011]31号
2012-08-13（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
596-600
