SPARC基因RNAi慢病毒载体的构建及其在SKM-1细胞中的表达
目的:构建SPARC基因RNAi慢病毒载体获得稳定产毒的细胞,并观察其对人MDS细胞株SKM-1细胞的转染效率及其对SPARC基因的抑制效率.方法:针对已经筛选确定的SPARC基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的OligoDNA,退火形成双链DNA,与经Age Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切后的pGCSIL-GFP载体连接产生GC-shSPARC慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆并进行测序鉴定.用GC-shSPARC、pHelper1.0和pHelper 2.0载体共转染包装细胞293T细胞,包装产生慢病毒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度,并将获得的重组慢病毒CC-shSPARC转染SKM-1细胞,通过荧光显微镜检测转染后GFP表达情况,测定转染效率；RT-PCR和Western blot分别验证转染后SKM-1细胞SPARC mRNA及蛋白的表达.结果:经测序证实,构建出了SPARC shRNA的慢病毒载体GC-sh SPARC.包装、浓缩病毒悬液的滴度为1×109 TU/mL.荧光显微镜下能直接观察到转染组细胞的GFP表达,转染效率为70％,RT-PCR、Western blot技术分别检测到GC-shSPARC慢病毒转染SKM-1细胞SPARC mRNA、SPARC蛋白表达水平较空白组明显降低(P＜0.05).结论:成功构建SPARC基因RNAi慢病毒载体,其能高效干扰SKM-1细胞SPARC基因的表达.
SPARC、RNA干扰、慢病毒、SKM-1
28
R511.3(传染病)
国家自然科学基金面上项目30971277;重庆市自然科学基金2009JJ0424;教育部留学回国人员启动基金2009年
2012-10-29（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
466-469
