构建人工合成的微小低氧反应元件可调控的AAV载体
目的:人工合成微小HER, 将其插入到AAV重组质粒的CMV启动子上游, 采用磷酸钙沉淀法包装低氧反应元件调控的AAV重组病毒, 为缺血性心脑血管病的基因治疗制备可以控制表达的AAV载体.方法:人工合成具有4次重复串联的低氧诱导因子结合位点(HIF-binding site, HBS)A/GCGTG(4 x HBS)的36 bp核酸片段和插入到CMV启动子TATA Box上游的间隔区35 bp的核酸序列, 并运用PCR方法 扩增.测序正确后, 通过常规分子生物学重组方法, 将原AAV载体质粒中CMV启动子替换成为含有最小人工合成HRE的CMV启动子, 重组构建了低氧反应元件调控的AAV载体.并在该载体CMV启动子下游的多克隆位点插入具有6 x His标签的NT4-6His-PR39融合肽序列.磷酸钙沉淀法包装表达NT4-6His-PR39融合肽序列的重组AAV.重组病毒感 染人宫颈癌细胞(HeLa), 化学性低氧培养, 使用免疫组织化学观察低氧条件的诱导表达作用.结果:基因测序结果和酶切结果表明, 我们已经把人工合成的HRE, 以正确的间隔插入到CMV启动子的上游, 成功地构建了HRE调控的AAV重组载体.重组病毒感染的细胞在常氧和低氧诱导表达的结果表明,在启动子上游插入人工合成的微小HRE能够有效调控重组腺相关病毒的表达.结论:使用PCR方法可以将人工合成的HER插入缺乏内切酶识别点的CMV启动子上游,可以制备低氧调控的真核表达载体.人工合成的微小HRE能够有效的调控CMV启动子控制的下游基因表达.该载体的成功制备在缺血性心脑血管病的预防和治疗中具有重要的理论和使用价值.
低氧反应元件(HRE)、重组腺伴随病毒、载体、低氧诱导
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Q782(基因工程（遗传工程）)
国家自然科学基金资助项目30871041
2011-04-29（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
278-280,283
