miR-196a靶向调控HOXA9基因的实验研究
目的:研究HOXA9基因的表观遗传学调控机制,筛选靶向调控HOXA9基因的microRNA.方法:利用Targetscan在线分析软件预测特异性靶向HOXA9基因3端非编码区域(3'UTR)的microRNA,采用PCR方法从1例健康供者DNA中扩增HOXA9基因3'UTR序列,插入经Xba Ⅰ和Pst Ⅰ双酶切的荧光素酶报告载体pGL3-M,采用脂质体SuperFect包裹荧光素酶重组质粒及microRNA表达质粒转染293T细胞,应用双荧光素酶检测试剂盒测定荧光素酶活性.构建miR-196a结合位点突变的HOXA9基因3'端非编码区域突变型荧光素酶报告载体,采用脂质体SuperFect包裹荧光素酶突变型重组质粒及miR-196a表达质粒转染293T细胞,应用双荧光素酶检测试剂盒测定荧光素酶活性.miR-196a mimics以脂质体Hipeffect转染至MV4-11细胞,实时定量PCR及Western blot检测HOXA9 mRNA及蛋白的表达.结果:成功构建了含有1 628 bp的HOXA9基因3'UTR序列的荧光素酶报告重组质粒pGL3-HOXA9-3'UTR,并通过酶切及基因测序方法的鉴定;荧光素酶报告实验提示miR-196a组荧光素酶活性明显低于对照组.成功构建了miR-196a的2个结合位点突变的HOXA9基因3'UTR序列的突变型荧光素酶报告重组质粒pGL3-HOXA9一mut3'UTR,并通过基因测序方法的鉴定.miR-196a可以下调野生型质粒的荧光素酶活性,不影响突变型质粒的荧光素酶活性.MV4-11细胞中过表达miR-196a,可以明显下调HOXA9 mRNA及蛋白表达.结论:miR-196a通过靶向结合HOXA9基因3'UTR的结合位点特异调控HOXA9基因.
microRNA、白血病、HOXA9基因、荧光素酶报告实验
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R392.2
国家自然科学基金资助项目30800482,90919044;国家重点基础研究发展计划973资助项目2005CB522400;首都医学发展科研基金资助项目2007-2040
2011-04-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
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