共表达IκBα-IRES2-CD40L胞外区双基因的腺病毒载体构建及鉴定
目的:构建含有分泌型人CD40L胞外区(shCD40L)和IκB的双基因共表达的腺病毒载体.方法:分别扩增出目的基因片段shCD40L、IκB和IRES2,将目的基因进行连接,得到IκB-IRES2和shCD40L两个基因片段,将其分别导入pGEMT-easy载体进行亚克隆扩增,测序正确后,再将连接成功地两个目的基因片段与分别与载体pshuttle-CMV连接获得穿梭质pshuttle-CMV-shCD40L和pshuttle-cmv-IκB-IRES2,将穿梭质粒在DH5α感受态细胞中扩增.再与AdEasy-1-BJ5183菌同源重组,得到含有两个目的基因的腺病毒骨架,脂质体法转染293细胞,包装成具有感染能力的共表达IκB-IRES2-shCD40L腺病毒颗粒.PCR法对腺病毒的上清液中的表达差异进行鉴定,检测病毒滴度,并用其感染细胞PK15和293细胞以检验其安全性.结果:所构建的IκB-IRES2-shCD40L基因的重组腺病毒,经酶切和PCR鉴定正确,原代腺病毒的滴度达到6.561×1012pfu/L,PCR法从提取的病毒上清液中分别扩增出了是shCD40L(600 bp)和IKBa(700 bp)的特异性片段,感染了腺病毒后的PK15细胞形态未见明显异常,但293细胞出现了明显的气球样变.结论:成功构建了共表达IκBα-IRES2-shCD40L双基因的腺病毒载体.
分泌型人CD40L胞外区、IκBα、重组腺病毒、免疫耐受
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R392.11
国家自然科学基金资助项目30772096,30972947;陕西省"13115"科技创新工程重大科技专项计划资助项目2007ZDKG-67;卫生部临床重点学科资助项目2004、2006年度;陕西省自然科学基金资助项目30571799
2011-03-09（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
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