人PD-1△ex3基因的克隆、表达及其生物学活性的鉴定

摘要：

目的:构建表达人PD-1△ex3(△PD-1)基因的真核表达载体,检测其表达和生物学活性.方法:通过RT-PCR的方法获得人PD-1全长(PD-1)基因,设计特异性引物,PCR方法获得PD-1△ex3基因的2个cDNA片段,通过重组PCR的方法获得△PD-1基因,将目的片段双酶切后与pIRES2-EGFP真核表达载体连接,构建重组真核表达载体pIRES2-EGFP/PD-1和pIRES2-EGFP/△PD-1并进行鉴定;脂质体转染法将重组载体导入293T细胞;流式细胞术(FCM)检测转染细胞膜表面PD-1的表达;Western blot法检测培养上清中可溶性PD-1(sPD-1)的表达;间接免疫荧光实验分析△PD-1蛋白与PD-1两个配体PD-L1和PD-L2的结合.结果:酶切和测序结果均证实插入的基因序列正确,成功构建两个真核表达载体;FCM分析和Western blot检测结果表明,PD-1转染细胞膜表面高表达PD-1蛋白,细胞培养上清中无sPD-1蛋白,而△PD-1转染细胞膜表面不表达PD-1蛋白,细胞培养上清中则有大量sPD-1;间接免疫荧光实验结果表明,△PD-1蛋白能够与PD-1两种配体产生特异性结合.结论:成功进行PD-1△ex3基因的真核表达,证实PD-1△ex3基因编码sPD-1蛋白,该蛋白具有良好的生物学活性,为进一步研究PD-1△ex3在PD-1/PD-L信号通路中的生物学作用提供了有价值的物质基础.

关键词：协同刺激分子、PD-1、PD-1△ex3、生物学活性

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分类号：R392.2

资助基金：国家自然科学青年基金资助30800997;苏州大学大学生课外学术科研基金资助KY2008001Z

在线出版日期：2010-05-19（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页码：207-210