抗人CD25分子单链抗体基因的构建、表达及初步鉴定

摘要：

目的:构建和表达抗人CD25分子单链抗体(scFv)蛋白, 并测定其生物学活性.方法:用RT-PCR方法从能分泌特异性抗CD25单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞中分离纯化抗体VH和VL基因.用重叠延伸PCR方法将VH和VL拼接在一起, 构建抗CD25分子scFv的基因.将scFv基因克隆至pMD18T, 用限制性内切酶切以及测序鉴定.将scFv 基因连接到pBAD/gⅢA表达载体, 转化Top10表达菌.阳性克隆用左旋阿拉伯糖诱导4 h, SDS-PAGE电泳检测蛋白纯度, 竞争抑制ELISA实验检测其活性.结果:scFv基因长度约为700 bp.通过DNA序列测定和分析, 构建出VL-(GGGGS)3-VH(但其中349位G突变为A, 使Linker其中一位Gly→Ser).其VH隶属于小鼠Ig重链可变区Ⅲ(C)亚类, 全长351 bp, 可编码117个氨基酸; 其VL隶属于小鼠Igκ轻链可变区Ⅳ亚类, 全长318 bp, 可编码106个氨基酸.TOP10中表达的scFv抗体加上同时融合表达的两个标签6×His和C-myc Mr约为31 000, 结果符合scFv的Mr.竞争抑制细胞ELISA实验显示表达的scFv具有活性.结论:此scFv基因的表达产物具有一定的特异结合活性.为抗CD25 scFv的临床应用打下了基础.

关键词：CD25、scFv、蛋白表达、ELISA

所属期刊栏目：23

分类号：R392.11

在线出版日期：2007-05-21（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共3页

页码：264-266