高效转染人T细胞的逆转录病毒载体系统的构建及应用

摘要：

目的: 构建能高效转染人T细胞并带有快速筛选标签的逆转录病毒载体系统,并与传统的逆转录病毒载体系统做比较.方法: 首先在原载体pCMMP-EGFP的基础上,构建携带内部核糖体进入位点(IRES)基因的逆转录病毒载体pCMMP-IRES-GFP.将嵌合T细胞受体基因插入该载体中,与另外两个辅助载体pMD.MLVgag.pol和pHDM.G共同转染包装细胞293T.48 h后收培养上清,高速离心病毒.同时将嵌合T细胞受体基因插入传统的逆转录病毒载体pLXSN中,并转染包装细胞PA317,用G418加压筛选出转染的PA317细胞克隆.扩大培养48 h后,收细胞培养上清即为病毒液,分别用上述两种方法得到的病毒液感染NIH3T3细胞,检测病毒的滴度.取适量病毒液感染用PHA激活后的人原代T细胞,48 h后在荧光显微镜下观察绿色荧光,并用流式细胞术(FCM)检测病毒感染的效率.结果: 成功地构建逆转录病毒载体pCMMP-IRES-GFP.将目的基因插入该载体中,与pMD.MLVgag.pol和pHDM.G共同转染包装细胞293T.培养48 h后,离心收获浓缩的上清中含有滴度为2.15×1011VP/L的病毒.以其感染用PHA激活后的人原代T细胞48 h后,在荧光显微镜下能观察到绿色荧光蛋白(GFP)的表达.FCM检测病毒对T 细胞的感染效率为50%～60%,并可用FCM进行分选.而用pLXSN载体转染的PA317细胞,包装得到的病毒滴度为6.43×109VP/L,病毒感染T细胞的效率仅为5%～10%.结论: 构建了能高效转染T细胞并带有快速筛选标签的逆转录病毒载体系统,为T细胞的基础与临床研究打下了基础.

关键词：逆转录病毒载体、T细胞、内部核糖体进入位点

所属期刊栏目：22

分类号：R392

资助基金：国家高技术研究发展计划863计划30200331

在线出版日期：2006-07-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共4页

页码：420-422,426