真核表达载体pIRES2-EGFP-NT3的构建及在豚鼠耳蜗成纤维细胞中的表达

摘要：

目的构建真核表达载体pIRES2-EGFP-NT3, 并观察其在豚鼠耳蜗成纤维细胞中的表达及分布.方法用RT-PCR法, 从人肝脏组织中克隆NT3-cDNA基因, 构建真核表达载体pIRES2-EGFP-NT3, 并经PCR及EcoR I/BamH I双酶切鉴定.用脂质体介导的方法, 将用真核表达载体pIRES2-EGFP-NT3瞬时转染豚鼠原代耳蜗成纤维细胞. 转染48 h后,分别在荧光显微镜下及用免疫组化法观察转染细胞中NT-3的表达.结果人NT-3 cDNA的PCR产物约为744 bp.序列测定结果用BLAST软件进行同源性比较, 同源性为100%.经EcoR I/BamH I双酶切证实, NT-3 cDNA已成功地克隆到真核表达载体pIRES2-EGFP中.用脂质体介导法,将pIRES2-EGFP-NT3瞬时转染豚鼠原代耳蜗成纤维细胞, 在荧光显微镜下观察到呈绿色荧光的成纤维细胞. NT-3免疫组化染色结果显示,转染NT-3基因的成纤维细胞胞浆呈棕黄色着色; 而转染空载体的成纤维细胞免疫组化染色呈阴性.结论成功地构建真核表达载体pIRES2-EGFP-NT3, 并在豚鼠耳蜗原代成纤维细胞中表达, 为NT-3基因转染治疗致聋豚鼠耳蜗动物试验奠定了基础.

关键词：NT-3、基因克隆、真核表达载体、成纤维细胞

所属期刊栏目：18

分类号：R322.85(人体形态学)

资助基金：第四军医大学校科研和教改项目

在线出版日期：2004-01-08（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共3页

页码：528-530