应用基因工程方法制备新型重组人肿瘤坏死因子-α

摘要：

目的应用基因工程技术,制备一种新型的重组人肿瘤坏死因子-α(novel recombinant human tumor necrosis factor-α,nrhTNF-α),并对其生物学活性、理化性质进行鉴定,为进入临床前研究提供基础.方法应用PCR技术,将hTNF-α基因的5′端1～7个氨基酸的编码序列删除,基因中Pro8Ser9Asp10的编码序列用Arg-Lys-Arg的编码序列取代,同时Leu157的密码子被Phe的密码子所取代.将hTNF-α突变基因,插入原核高效表达载体pBV220中,构建高表达工程菌株.纯化表达产物,对连续3批制备的新型rhTNF-α,按人用<重组DNA制品质量控制要点>检定要求进行鉴定.结果DNA序列分析和蛋白质N末端、C末端部分氨基酸序列分析表明,nrhTNF-α与天然的hTNF-α相比较,N末端缺失了7个氨基酸,1～3位氨基酸为Arg-Lys-Arg,其后为天然hTNF-α 11位以后的氨基酸.157位Leu的密码子被Phe的密码子所取代.产物表达量占菌体蛋白的67.4%.经(NH4)2SO4沉淀、Q-Sepharose F.F.及S-Sepharose F.F.柱层析分离纯化后,产品的纯度达99%,比活性达1×109IU/mg蛋白.结论成功地制备了nrhTNF,对连续3批制备的nrhTNF-α按人用<重组DNA制品质量控制要点>检定要求进行鉴定,所有项目均合格.

关键词：重组人肿瘤坏死因子-α、基因表达、大肠杆菌

所属期刊栏目：18

分类号：R392.12

在线出版日期：2004-01-08（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共4页

页码：402-405