利用CRISPR/Cas9技术构建CREB基因敲除细胞系并探讨CREB对APP基因表达的调控作用
环磷腺苷效应元件结合蛋白(cAMP responsive element-binding protein,CREB)是重要的核转录因子,有研究表明,在阿尔茨海默病患者中,CREB的表达降低,但CREB对于淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein,APP)的作用机制尚不清楚.该研究通过设计sgRNA序列并合成相应的寡核苷酸,将其克隆到pX459质粒中,构建CREB基因敲除的CRISPR/Cas9二合一表达载体.将构建成功的载体转染到HT22细胞中,通过TA克隆测序和T7E1酶切分析来验证sgRNA的活性.将构建的载体转染到HT22细胞中,用嘌呤霉素进行药物筛选,构建稳定的CREB基因敲除的细胞系.CREB对APP基因表达的调控作用通过检测其在正常HT22细胞和CREB基因敲除的HT22细胞系中的表达情况来进行确认.结果显示,成功构建了CRISPR/Cas9技术对CREB基因进行敲除的二合一表达载体,所设计的sgRNA的插入序列和开放阅读框架完全正确,经过酶切分析和序列测定,所构建的载体与实验设计相一致.CREB基因敲除的HT22细胞系其敲除效率达到90％以上.通过Western blot分析检测CREB对APP表达的影响,结果发现,当CREB基因敲除后,APP表达增加,而过表达CREB时,则APP蛋白质表达水平下降.这提示,CREB对APP的表达有下调作用,具体的机制还将继续研究.
CRISPR/Cas9、CREB、基因敲除、APP基因表达、阿尔茨海默病
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R749.16;R285.5;R373.21
2017-10-20（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
共9页
1147-1155
