融合蛋白CTP-FoxM1诱导C57BL/6小鼠骨髓来源树突状细胞的活化

摘要：

树突状细胞(dendritic cells,DCs)疫苗负载的肿瘤抗原可以使DCs大量表达表面分子Ⅱ类组织相容性抗原(major histocompatibility complex class-Ⅱ,MHC-Ⅱ)及共刺激分子CD40、CD80、CD86,促进Th1(T helper 1)型细胞因子的分泌,从而可以将肿瘤抗原充分递呈给T淋巴细胞,诱导机体产生杀伤肿瘤细胞的免疫应答.其中,肿瘤抗原是否能充分活化DCs是机体发挥抗肿瘤免疫应答的关键.该研究以融合蛋白CTP-FoxM1(cytoplasmic transduction peptide-forkhead box M1)为研究对象,探讨其对C57BL/6小鼠骨髓来源DCs的活化作用.首先,分别将胞质转导肽(cytoplasmic transduction peptide,CTP)、FoxM1 (forkhead box M1)抗原相关基因连接入pCOLD-TF-DNA,构建重组原核表达质粒pCOLD-TF-CTP-FoxM1,转化感受态大肠杆菌BL21,IPTG(isopropy1β-D-1-thiogalactopyranoside)诱导表达,经亲和纯化、Western blot验证得到融合蛋白CTP-FoxM1.然后,用CCK-8试剂盒检测经不同浓度的融合蛋白CTP-FoxM1处理48 h后的DCs的存活率;用激光共聚焦显微镜观察融合蛋白CTP-FoxM1在DCs的定位情况;流式细胞仪检测DCs表面MHC-Ⅱ类分子和共刺激分子CD40、CD80、CD86的表达情况;ELISA法检测DCs培养上清中细胞因子白介素-12(interleukin-12,IL-12)的分泌水平.结果显示:CTP-FoxM1对DCs的生长有一定的抑制作用,且与其浓度有关,浓度为1 μg/mL的融合蛋白CTP-FoxM1处理组的DCs存活率(80.93％±8.36％)明显高于浓度为2 μg/mL融合蛋白CTP-FoxM1处理组DCs的存活率(70.13％±5.38％,P＜0.001)和4μg/mL融合蛋白CTP-FoxM1处理组DCs的存活率(62.97％±4.06％,P＜0.001).在激光共聚焦显微镜下可以观察到该融合蛋白能够在DCs胞质内定位,与对照组相比,该融合蛋白可以上调DCs表面MHC-Ⅱ类分子和共刺激分子CD40、CD80、CD86的表达量(P＜0.01,P＜0.05)及细胞因子IL-12的分泌量(P＜0.001).结果提示,融合蛋白CTP-FoxM1能促进DCs的活化,对肝癌的免疫治疗有一定的潜能,为下一步探索融合蛋白CTP-FoxM1负载的DCs是否能够在体内发挥免疫效应奠定了一定的基础.

关键词：胞质转导肽、原核表达、蛋白纯化、树突状细胞、疫苗、肿瘤免疫

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资助基金：国家自然科学基金批准号:81272545资助的课题;This work was supported by the National Natural Science Foundation of China Grant No.81272545

在线出版日期：2015-06-26（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页码：638-647