不同浓度Wnt-11诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞定向分化的实验研究

摘要：

目的 探讨Wnt-11体外诱导骨髓间充质干细胞(BMMSCs)分化为心肌样细胞的最适浓度.方法 采用全骨髓贴壁法分离培养SD大鼠BMMSCs,取第2代BMMSCs培养48 h后进行定向诱导,根据Wnt-11终浓度的不同分为A组(100 ng/mL),B组(200 ng/mL),C组(400 ng/mL)和D组(空白对照组),诱导72 h后更换为完全培养液继续培养4周,D组仅用完全培养液培养.倒置相差显微镜下观察培养细胞的形态学变化.运用流式细胞仪检测技术对BMMSCs表面联合标记物进行鉴定.各组细胞培养至第4周时,运用免疫细胞化学染色技术检测结蛋白(Desmin)、间隙连接蛋白43(Connexin43)及心肌肌钙蛋白I(cTnI)的表达情况.运用透射电镜观察分化细胞的超微结构变化.实时荧光定量多聚核苷酸链式反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测各组细胞在诱导后培养第1、2、4周时心肌早期转录因子GATA-4、Nkx2.5及α-MHC的表达.结果 ①原代BMMSCs于第2周形成集落,多呈梭形、星形,少数形状不规则.传代后细胞体积变大,诱导后细胞多为长梭形,呈一致性生长.②流式细胞仪检测技术对BMMSCs表面联合标记物的鉴定结果显示CD29、CD45、CD90的阳性表达率分别为97.9%、0.4%和99.5%.③免疫细胞化学染色技术检测结果显示:诱导后常规培养至第4周,A组、B组、C组细胞胞质均呈阳性表达Desmin、Connexin43和cTnI,而D组细胞呈弱阳性或阴性表达,B组细胞的阳性表达率均最高,差异具有统计学意义(P<0.05).④透射电镜结果显示:各诱导组细胞于诱导后常规培养至第4周,胞质内可见平行排列的肌丝及亚细胞结构如线粒体、粗面内质网和核糖体.⑤RT-qPCR检测结果显示:BMMSCs经诱导后,常规培养第1周时各诱导组细胞均表达GATA-4及Nkx2.5基因,在第2周时表达减弱,在第4周时表达增强,就基因表达而言,三个诱导组相比较,B组明显优于其他两组(P<0.05).α-MHC基因在诱导后常规培养期间均不表达.对照组细胞在常规培养期间GATA-4及Nkx2.5基因的表达量为1,而不表达α-MHC基因.结论 Wnt-11可在体外诱导SD大鼠BMMSCs定向分化为心肌样细胞,其诱导分化最适浓度为200 ng/mL.

关键词：骨髓间充质干细胞、Wnt-11、心肌样细胞、细胞分化

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分类号：R741(神经病学与精神病学)

资助基金：河北省自然科学基金H2015405017;河北北方学院创新培育项目CXRC1315;河北省教育厅重大项目ZH2012001;河北省自然科学基金No.H2014405005 Supported by the Natural Science Foundation of Hebei ProvinceH2015405017,H2014405005;the Innovation Cultivation Program of Hebei North UniversityCXRC1315;the Major Programs of Educational Commission of Hebei ProvinceZH2012001

在线出版日期：2017-03-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共7页

页码：199-205