靶向RWDD3基因shRNA慢病毒载体的构建及功能鉴定

摘要：

目的 构建RWD结构小泛素化增强子(RWDD3) shRNA慢病毒表达载体,为探讨RNA干扰技术抑制人脑胶质瘤细胞RWDD3基因的相关研究奠定基础.方法 设计RWDD3的3条siRNA的靶点序列,合成含干扰序列的双链DNA发卡结构shRNA,分别与双酶切后的载体连接,构建3种重组质粒pGC-LV-shRNA1、pGC-LV-shRNA2和pGC-LV-shRNA3,并转化于DH5α感受态细胞,提取阳性克隆质粒测序,转染293T细胞,生产慢病毒颗粒,并检测病毒滴度.将3种重组慢病毒及阴性对照病毒分别感染人脑胶质瘤细胞U251,实时定量PCR和Western blot分别检测RWDD3 mRNA和蛋白的沉默效果.结果 测序结果证实3种慢病毒载体均包装成功,滴度分别为5×1011 TU/L、4×1011 TU/L、5×1011TU/L.感染U251后,RWDD3 mRNA及蛋白的表达量均较阴性对照组和未感染组明显降低(P＜0.05);其中以LV-RWDD3-shRNA-1作用显著,mRNA表达下调79.2％,蛋白表达下调68.2％ (P＜0.05);而阴性感染对照组和未感染组相比差异无统计学意义(P＞0.05).结论 成功构建3种RWDD3 shRNA慢病毒表达,可有效下调U251细胞RWDD3 mRNA和蛋白的表达,其为进一步研究以RWDD3为靶点的脑胶质瘤基因治疗提供稳定转染细胞的载体奠定基础.

关键词：脑胶质瘤、RWDD3、慢病毒、shRNA

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分类号：R739.41(肿瘤学)

资助基金：江西省自然科学基金计划项目20132BAB205043;江西省教育厅科学技术研究项目GJJ14066;the Natural Science Foundation Project of Jiangxi Province20132BAB205043;the Science and Technology Research Project of Department of Education of Jiangxi ProvinceGJJ14066

在线出版日期：2016-04-19（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共7页

页码：14-20