携带 CIP2A shRNA 重组腺相关病毒载体的构建及其鉴定

摘要：

目的：构建携带 CIP2A shRNA 重组腺相关病毒载体,制备靶向性沉默 CIP2A 表达的高浓度重组腺相关病毒。方法设计合成 CIP2A shRNA,退火形成双链与 pDC316-EGFP-U6质粒 BamHⅠ和 HindⅢ双酶切产物相连接构建形成质粒 pDC316-EGFP-CIP2A shRNA,以鉴定正确的 pDC316-EGFP-CIP2A shRNA 克隆为模板 PCR 扩增 EGFP-CIP2A shRNA 片段,EcoRⅠ和 SalⅠ双酶切 PCR 扩增产物及 pSNAV2.0质粒后进行连接形成重组质粒 pSNAV2.0-EGFP-CIP2A shRNA,建立载体细胞株 BHK/CIP2A-shRNA,采用 AAV MaxTM 包装系统大规模制备 rAAV2-EGFP-CIP2A shRNA 并对其纯化及滴度测定。将 rAAV2-EGFP-CIP2A shRNA 感染肝癌细胞 HepG2,利用空载病毒载体rAAV2-EGFP 作对照,采用 Real-time PCR 及 Western blot 方法检测 CIP2A shRNA 基因沉默效果。结果携带编码CIP2A shRNA 腺相关病毒载体质粒 pSNAV2.0-EGFP-CIP2A shRNA 经双酶切及测序鉴定,质粒构建正确；将重组质粒与辅助病毒 HSV1-rc/ΔUL2共转染包装细胞 BHK-21,成功制备重组腺相关病毒 rAAV2-CIP2A shRNA,经测定纯化所得 rAVV2病毒滴度为0.25×1012 v.g./mL。筛选 MOI 值为1×105感染肝癌细胞 HepG2,CIP2A mRNA 及蛋白表达水平分别于感染后24 h 和48 h 与对照细胞相比出现明显下降。结论成功制备高滴度携带 CIP2A shRNA重组腺相关病毒载体 rAAV2-CIP2A shRNA。

关键词：CIP2A、RNA 干扰、重组腺相关病毒、短发卡 RNA

分类号：R737.9(肿瘤学)

在线出版日期：2015-11-20（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共6页

页码：743-748