小反应体积实时定量PCR的可行性评价

摘要：

目的 从扩增稳定性、扩增效率以及可靠性等多方面评估实时定量PCR(RtPCR)反应小体积的可行性,同时确定适合小体积体系的模板量.方法 将实验分为10、15、20μL 3个体积组,每组分别采用0.1、0.2、0.3、0.4μL的大鼠cDNA为模板,进行大鼠β-actin mRNA的RtPCR扩增.通过扩增曲线和熔解曲线考察反应的稳定性,以梯度模板拟合标准曲线获得反应的扩增效率,其线性相关程度反映模板量是否合适.另外,构建大鼠降植烷诱导的关节炎(pristane-induced arthritis, PIA)模型,采用选定的反应体系,分别对模型组和正常组大鼠脾脏TNF-α mRNA进行扩增,通过TNF-α的相对表达趋势反映小体积扩增的可靠性.结果 在大鼠β-actin mRNA的RtPCR扩增中,10、15、20μL 3个体积组均能特异稳定地进行扩增,并保证高扩增效率.而且每个体积组中的模板梯度表现出很好的线性相关趋势.同时选用10μL和20μL反应体积、0.2μL模板对关节炎大鼠脾脏进行TNF-α mRNA扩增,结果一致表现出了预期的显著性上调.结论 实验证实10μL、15μL等小反应体积应用于RtPCR扩增中是可行的,具有较好的稳定性和可靠性,同时0.1～0.4μL cDNA模板在3种体系的合适模板范围内.这种较小的PCR反应体积,不仅节省了试剂和实验材料,对一些来之不易的临床标本尤为重要,也利于高通量大规模的RtPCR检测的实现.

关键词：实时定量PCR、小反应体积、稳定性、可靠性

所属期刊栏目：31

分类号：Q33(人工选择与自然选择)

资助基金：国家自然科学基金30801027, 30630058;陕西省国际合作项目2007-KW-06Supported by the National Natural Science Foundation of China30801027, 30630058;Shaanxi Province International Cooperation Foundation2007-KW-06

在线出版日期：2010-04-14（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共4页

页码：177-180