基质金属蛋白酶-9靶向RNA干扰重组载体的构建和效应检测

摘要：

目的:构建针对人基质金属蛋白酶-9(MMP-9)小干扰RNA(siRNA)表达载体, 并观察其对川崎病(KD)血清诱导的血管内皮细胞MMP-9高表达的干扰效果.方法:依据siRNA设计原则设计两对MMP-9基因的特异性干扰序列, 体外分别合成两端含BamHⅠ和 Hind Ⅲ酶切位点的编码短发夹RNA序列的DNA单链,退火后与pSilencer3.1-HI neo线性质粒连接,转化DH5α感受态菌株,筛选阳性克隆,提取质粒进行双酶切及琼脂糖电泳鉴定.阳性重组质粒测序.将构建的两个MMP-9 siRNA质粒以KD血清作为诱导因子,用脂质法转染内皮细胞ECV-304,应用RT-PCR 法测定各实验组血管内皮细胞MMP-9 mRNA 表达、Western blot检测各组MMP-9蛋白表达情况,对所构建的MMP-9siRNA质粒进行效应检测.结果:DNA测序证实合成的并被克隆入pSilencer3.1-HI neo表达质粒siRNA插入序列与设计完全符合.KD血清组MMP-9蛋白及mRNA表达水平均较正常血清组明显升高(P<0.05);而所构建的两个MMP-9 siRNA及人血丙种球蛋白均能显著抑制KD血清的上述诱导作用(P<0.05).结论:成功构建的两个MMP-9 siRNA比人血丙种球蛋白更能高效、特异地抑制MMP-9的表达,为进一步研究MMP-9基因对KD冠状动脉病变的影响及其临床应用奠定了基础.

关键词：小干扰RNA、基质金属蛋白酶、川崎病、血管内皮细胞

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分类号：R725.9;R344+.14(儿科学)

资助基金：广东省自然科学基金项目07002329;广州市医药卫生科技项目2005-YB-058、2007-YB-061、2007-YB-067;广东省医学科学技术研究基金项目A2008548;广东省科技计划项目73098

在线出版日期：2009-12-25（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共6页

页码：17-21,前插5