β-葡萄糖苷酶Bgl747的定向筛选、重组表达与酶学性质

摘要：

[背景]β-葡萄糖苷酶(β-Glucosidase,EC3.2.1.21)是3种纤维素酶中的重要成分之一.目前工业用纤维素酶大都来源于木霉等真菌,较少来源于细菌,而且在应用中还存在反应条件(温度、pH等)适用范围窄、酶活力较低、获取成本偏高等问题,这大大限制了β-葡萄糖苷酶的应用.从秸秆还田土壤细菌中筛选β-葡萄糖苷酶有极大地可能性筛选出酶学性质较好的酶,从而解决现存的工业问题.[目的]从土壤中筛选β-葡萄糖苷酶,通过基因重组、表达优化和蛋白纯化获得一株新型β-葡萄糖苷酶,探究其酶学性质,为其在工业上的应用奠定基础.[方法]利用功能筛选法从土壤中筛选出β-葡萄糖苷酶,全长为747 bp,命名为Bgl747,构建重组表达质粒pET-28a-Bgl747,以Escherichia coli BL21 (DE3)为宿主菌株,经IPTG诱导实现可溶性表达并优化表达条件,通过His标签蛋白纯化试剂盒纯化获得纯化酶,探究其酶学性质.[结果]β-葡萄糖苷酶Bgl747属于BglB超家族,分子量为27.23kD,最适反应温度为45℃,最适pH 4.0;最佳诱导条件:当OD600为1.0,加入终浓度为0.6 mmol/L的IPTG,于37℃、220 r/min诱导10 h后β-葡萄糖苷酶Bgl747蛋白获得最高表达量1.82 mg/mL;底物为对硝基苯-β-D-半乳糖苷(p-Nitrophenyl-β-D-Galactopyranoside,pNPG)时的比酶活225.07 U/mg,米氏常数Km值和最大反应速率Vmax分别为0.268 mmol/L、547.23 μmol/(L·min);l mmol/L K+、l mmol/L和10 mmol/L Fe2+、30％甲醇、30％乙醇、l mmol/L和10 mmol/L盐酸胍对酶活都有促进作用,30％ TritonX-100及10 mmol/L SDS抑制其酶活效果较为明显;该酶受到产物葡萄糖的反馈抑制,葡萄糖浓度越高,抑制效果越明显,但当葡萄糖浓度为1 mol/L时,酶活仍保持50％以上.[结论]Bgl747反应温度范围较广且稳定,酶学性质优异,为其在纤维素降解等工业应用奠定基础.

关键词：β-葡萄糖苷酶;秸秆;功能筛选;重组表达;酶学性质

所属期刊栏目：48

资助基金：国家自然科学基金;广州市科技计划;广东药科大学创新强化学校项目;广东省科技计划

在线出版日期：2021-09-13（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共10页

页码：2524-2533