内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶关键氨基酸位点的改造提高对烷基取代2-酮酸的催化活力

摘要：

[背景]高效实现D-氨基酸的生物合成一直是人们关注的热点.内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶(meso-diaminopimelate dehydrogenase,DAPDH)能够直接催化2-酮酸和氨合成D-氨基酸.[目的]提高DAPDH对烷基取代2-酮酸的催化活力,并解释其催化机制.[方法]以来源于嗜热共生杆菌(Symbiobacterium thermophilum)的内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶(StDAPDH)为模板,在前期结构分析结合被选择位点突变结果的基础上,确定对H227位进行定点饱和突变,并以D-丙氨酸、D-2-氨基丁酸、D-正-缬氨酸、D-谷氨酸为底物进行筛选.[结果]获得突变体H227Q和H227N.突变体H227Q对丙酮酸、2-氧代丁酸、2-氧代戊酸、2-酮戊二酸的比活力比野生型分别提高了10.9、11.5、8.6和7.6倍.动力学参数表明,突变体H227Q同时提高了酶对底物的亲和力及催化常数,使其对丙酮酸的催化效率(kcat/Km)相较于野生型提高了9.4倍.利用分子模拟技术分析突变体H227Q与产物氨基酸之间的相互作用表明,227位的谷氨酰胺通过与氨基酸的羧酸形成氢键,使得氨基酸产物Ca上的氢和辅酶烟酰胺环C4原子之间的距离缩短.[结论]利用定向进化技术提高DAPDH对烷基取代2-酮酸的催化活力,有助于开发新型的高效生物催化剂,这些工作也为下一步继续进行更具挑战性的D-氨基酸研究提供了基础.

关键词：烷基取代2-酮酸、内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶、饱和突变、分子对接、D-氨基酸

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资助基金：国家自然科学基金;天津市科学技术委员会项目;天津市教委科研计划

在线出版日期：2020-08-19（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共9页

页码：2119-2127