基于Qβ噬菌体的甲肝病毒装甲RNA标准参考样品的研制

摘要：

[背景]目前食品中甲肝病毒分子的检测缺乏安全、稳定的RNA标准参考样品,影响了检测结果的科学性与准确性.[目的]基于Qβ噬菌体装甲RNA技术构建内含甲肝病毒检测靶标的装甲RNA (HepatitisAvirus armored RNA,AR-HAV),并开展初步定值、均匀性、稳定性研究,为HAV分子检测提供标准参考样品.[方法]人工合成包含Qβ噬菌体成熟酶编码基因、衣壳蛋白编码基因、包装位点、HAV检测靶标cDNA序列的核酸片段QGBHAV,并亚克隆到pET-28a(+)中构建重组质粒pET-QGBHAV,转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行原核表达,利用超速离心、丙烯葡聚糖凝胶层析柱纯化AR-HAV后电镜观察.通过实时荧光RT-PCR对AR-HAV进行初步定值及均匀性和稳定性研究.[结果]SDS-PAGE结果表明重组质粒在大肠杆菌中有约14.1 kD的目的蛋白表达;纯化后的AR-HAV无杂蛋白和残留质粒;电镜下可见结构完整、大小约为25 nm的病毒样颗粒;定值结果显示,AR-HAV中检测靶标RNA的含量为(2.57±0.12)× 107 copies/μL;均匀性分析结果为F=1.23＜F0.05 (9,20),证实AR-HAV的均匀性良好;稳定性结果表明,AR-HAV在可37℃保存9d,25℃保存25 d,4℃保存40 d,-20℃保存180 d,-80℃至少保存360 d.[结论]基于Qβ噬菌体制备的AR-HAV拷贝数高,具有良好的均匀性和稳定性,可为HAV的分子检测提供安全、稳定的标准参考样品.

关键词：甲肝病毒、Qβ噬菌体、装甲RNA、标准参考样品、实时荧光RT-PCR

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资助基金：国家科技基础性工作专项2013FY113300;中国水产科学研究院基本科研业务费专项2016HY-ZD11;国家贝类产业技术体系CARS-47

在线出版日期：2019-03-07（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共8页

页码：209-216