重组瑞替普酶在毕赤酵母中的表达

摘要：

[目的]瑞替普酶(重组组织纤溶酶原激活物,rtPA)被认为是第三代安全有效的溶栓剂,以pPIC9K为载体,以3种不同表型的毕赤酵母(Pichia pastoris)为宿主,探索适合rtPA分泌型表达的最佳体系.[方法]以质粒pET28a-rtPA为模板,设计特异性引物,PCR扩增目的基因rtPA,插入分泌型表达载体pPIC9K中,获得重组表达质粒pPIC9K-rtPAo重组质粒经限制性内切酶Sal Ⅰ线性化后,电击转化至3种不同表型的P.pastoris (GS 115、SMD1168、KM71)中进行组成型表达;重组表达体系进行甲醇诱导表达,对产物进行Western blot鉴定,并采用纤维蛋白平板溶圈法测定其活性.[结果]重组蛋白分子量约为43 kD;rtPA-GSll5和rtPA-KM71均在39 kD处有特异性条带,且前者在32 kD处有轻微降解条带,而后者并无此现象;rtPA-SMD 1168无降解现象,且rtPA-SMD 1168比活性较rtPA-GS 115高27％;rtPA-KM71表达量和活性均为最低.[结论]从重组蛋白生物活性出发,P.pastoris SD1168可作为rtPA的最佳表达体系,在控制宿主蛋白酶活性、减少产物降解的前提下,P.pastoris GS 115也是rtPA表达的优选体系.

关键词：瑞替普酶、组织纤溶酶原激活物、毕赤酵母、纤溶活性

所属期刊栏目：44

分类号：R97;R3

资助基金：National High-Tech Research and Development Program of China 863 Program No.2012AA022204C国家高技术研究发展计划863计划项目2012AA022204C

在线出版日期：2017-11-10（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共8页

页码：2145-2152