三氯卡班降解菌株Sphingomonas sp.YL-JM2C中多个邻苯二酚双加氧酶的功能

摘要：

[目的]研究Sphingomonas sp.YL-JM2C菌株的生长特性,确定以三氯卡班作为碳源的生长情况.挖掘菌株YL-JM2C潜在的邻苯二酚1,2-双加氧酶及邻苯二酚2,3-双加氧酶基因,在大肠杆菌(Escherichia coli)中异源表达邻苯二酚双加氧酶基因并研究其酶学性质.[方法]优化S.sp.YL-JM2C菌株以三氯卡班作为碳源时的培养条件,并利用全自动生长曲线测定仪测定菌株生长情况,绘制生长曲线.通过生物信息学方法挖掘潜在的邻苯二酚双加氧酶基因,并分别在Escherichia coli BL21 (DE3)中进行异源表达,通过AKTA快速纯化系统纯化蛋白,分别以邻苯二酚、3-和4-氯邻苯二酚为底物检测重组蛋白的酶学特性.[结果]菌株在pH为7.0-7.5时生长最优.在以浓度为4-8 mg/L的三氯卡班做为底物时,菌株适宜生长.当R2A培养基仅含有0.01％酵母提取物和无机盐时,加入终浓度为4 mg/L的三氯卡班可促进菌株生长.挖掘-6个潜在的邻苯二酚双加氧酶基因stcA1、stcA2、stcA3、stcE1、stcE2和stcE3,表达并通过粗酶液分析证明其中5个基因stcA1、stcA2、stcA3、stcE1和stcE2编码的酶均具有邻苯二酚双加氧酶和氯邻苯二酚双加氧酶的活性;纯化酶的底物范围研究揭示了StcA1、StcA2和StcA3均属于Ⅱ型邻苯二酚1,2-双加氧酶,StcE1和StcE2为两个新型邻苯二酚2,3-双加氧酶;它们酶动力学分析研究证明了5个酶对邻苯二酚的亲和力和催化效率最高,4-氯邻苯二酚次之.[结论]在同一菌株中发现了5个具有功能的邻苯二酚双加氧酶基因,stcA1、stcA2和stcA3编码的酶均属于Ⅱ型邻苯二酚1,2-双加氧酶,stc E1和stcE2为两个新型邻苯二酚2,3-双加氧酶编码基因.5个酶均具有催化邻苯二酚和氯邻苯二酚开环反应的功能,这为更好地理解微生物基因组内代谢邻苯二酚及其衍生物氯代邻苯二酚基因的多样性奠定了基础.

关键词：鞘氨醇单胞菌YL-JM2C、三氯卡班、邻苯二酚、3-氯邻苯二酚、4-氯邻苯二酚、邻苯二酚1、2-双加氧酶、邻苯二酚2、3-双加氧酶

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分类号：X70;O65

资助基金：国家自然科学基金项目No.31370094,31570100National Natural Science Foundation of China 31370094,31570100

在线出版日期：2017-09-06（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共12页

页码：1513-1524