全细胞高通量筛选α-氨基酸酯水解酶突变体的方法

摘要：

[目的]建立高效敏感的高通量筛选方法,用于筛选头孢克洛合成活性提高或热稳定性提高的α-氨基酸酯水解酶.[方法]根据头孢克洛在碱性条件下水解生成的衍生物在340 nm处有特征吸收峰的原理,制作出标准曲线.采用全细胞96孔板紫外分光光度法高通量测定α-氨基酸酯水解酶突变体的头孢克洛合成活性.[结果]头孢克洛含量与△A340-405在(0.1-0.6)×10-3 mol/L浓度范围内有良好的线性关系,服从朗伯-比尔定律,平均回收率为99.8％-101.3％.一轮定点饱和突变产生的2 300个克隆经该方法的筛选,获得3株Kcat提高40％以上,4株半失活温度较野生型提高5℃以上的突变体酶.[结论]该方法准确可靠,每天筛选量可达到2 000个反应,达到高通量筛选的要求.

关键词：α-氨基酸酯水解酶、头孢克洛、紫外分光光度法、全细胞高通量筛选、定向进化

所属期刊栏目：39

分类号：R96(药理学)

资助基金："十二五"重大新药创制科技重大专项项目2011ZX09401-403;四川省国际科技合作与交流研究计划项目2010HH0036;成都市科技计划项目10GGYB297SW-182

在线出版日期：2012-05-17（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页码：264-271