利用CRISPR/Cas9系统构建稳定敲除anxa6基因的Caco-2细胞株
[目的]利用CRISPR/Cas9系统构建稳定敲除anxa6基因的Caco-2细胞株,为研究大肠杆菌O157∶H7效应蛋白EspF与宿主膜联蛋白A6(ANXA6)相互作用及其致病机制奠定基础.[方法]根据CRISPR/Cas9靶向原理设计并合成3个特异性识别anxa6基因的向导RNA(single guide RNA,sgRNA),基于 LentiCRISPRv2 载体构建 LentiCRISPRv2-sgRNA 重组质粒,转入 293T细胞中,制备sgRNA-Cas9慢病毒,将慢病毒感染Caco-2细胞,经嘌呤霉素筛选阳性细胞,有限稀释法分离培养单克隆细胞,提取单克隆细胞基因组DNA,并对敲除位点附近的DNA片段进行PCR扩增,测序并进行脱靶效应评估;免疫印记法检测ANXA6蛋白表达情况,细胞计数试剂盒8(cell counting kit 8,CCK8)试剂盒检测细胞增殖能力,免疫荧光法检测细胞紧密连接分布情况.[结果]Western blotting及序列测序表明anxa6基因敲除单克隆细胞构建成功;脱靶效应评估结果显示预测的 10个脱靶位点均无脱靶现象;基因敲除对细胞增殖能力无明显影响;免疫荧光结果显示,Caco-2及Caco-2anxa6-/-细胞紧密连接蛋白ZO-1均沿细胞膜连续分布,结构完整,转染EspF质粒后出现分布不完整、缺口等现象.[结论]成功构建anxa6基因稳定敲除的Caco-2细胞株,初步探索ANXA6蛋白在紧密连接分布中的作用,为进一步研究大肠杆菌O157∶H7通过EspF-ANXA6互作介导宿主肠屏障损伤分子机制提供技术支撑.
CRISPR/Cas9系统、anxa6、EspF蛋白、Caco-2细胞、紧密连接
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R734.2;R378.21;R655.3
广东省自然科学基金项目;广东省基础与应用基础研究基金;国家自然科学基金
2023-04-13（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
共13页
1217-1229
